[发明专利]修饰有核苷酸的微小管的合成方法和保存方法

说明书

技术领域

泛泛地说，本发明涉及微小管的合成，特别是涉及以不依赖于生物素-抗生物素蛋白结合的方法而合成修饰了核苷酸(DNA或RNA)的微小管的方法，以及与此相伴的保存、再合成的方法。

背景技术

在真核细胞中，作为细胞骨架的肌动蛋白丝和微小管发达，以这些为轨道，在其上通过驱动蛋白和动力蛋白等马达蛋白质来传输细胞内小器官和运输小泡等运输分子。此外，驱动蛋白和微小管的相互作用所代表的分子运输机制也可在生物体外再构建，并且使微小管在固定于基板上的驱动蛋白上进行滑走运动的滑动试验(gliding assay)系统也广为人们所知。

作为将这种优异的生物功能在工程学上应用于人工的分子运输系统的尝试，以下实例已有报告：通过对进行滑走运动的微小管表面进行生物化学修饰来实现功能化(例如，参见非专利文献1)。在该尝试中，已成功地将进行滑走运动的微小管表面的一部分生物素化，并使其与表面修饰有链霉抗生物素蛋白的微珠(microbeads)等运输分子发生生物素-抗生物素蛋白结合，由此将运输分子装载在微小管上来进行传输。但是，在生物系统的相互作用中，生物素-抗生物素蛋白结合是具有最高亲和力的结合之一，这点是广为人们所知的，一旦将运输分子装载到微小管上，则存在本质上不可能卸载这样的问题。

相对于此，公开了以下系统：通过将进行滑走运动的微小管表面的一部分生物素化，并使其与末端修饰有链霉抗生物素蛋白的单链DNA发生生物素-抗生物素蛋白结合，由此制作出修饰有单链DNA的微小管；通过微小管与具有互补的碱基序列的DNA的杂交来进行装载，并通过添加限制酶来切割DNA而进行卸载(例如，参见专利文献1和2)。

但是，存在以下问题点：只能使单链DNA结合在得到生物素化的位点上，而且由于抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白是分子量较大(60kDa～67kDa)的分子，因此不能自由设定单链DNA对微小管的修饰比例(标记率)。因而，若为某恒定值以上的标记率，则也可能妨碍微小管的滑走运动。

非专利文献1：H.Hess等，“Light-Controlled Molecular Shuttles Madefrom Motor Proteins Carrying Cargo on Engineered Surfaces，”Nano Letters，Vol.1，no.5，pp.235-239，2001。

专利文献1：日本特开2006-204241号公报

专利文献2：日本特开2006-271323号公报

在本件专利申请之前，本发明人提出了以下系统：制作出修饰有DNA的微小管，对于该修饰有DNA的微小管而言，不仅利用了生物素-抗生物素蛋白结合，而且还着手使用了化学交联剂，并仅利用杂交就实现了对运输分子选择性且自律性的装载和卸载的机制(未公开的日本特愿2005-307880)。但是，在该提案中，对于修饰有DNA的微小管的具体合成方法没有提及。

于是，本发明的课题在于，提供以不依赖于常用的生物素-抗生物素蛋白结合的方法而合成修饰有核苷酸的微小管的方法以及与此相伴的保存、再合成的方法。

发明内容

为了实现上述课题，在本发明中，使(a)聚合后已稳定的微小管、(b)具有琥珀酰亚胺部分和马来酰亚胺部分的化学交联剂与(c)3’末端或5’末端被巯基化(チオ一ル化)的核苷酸反应，合成出微小管-化学交联剂-核苷酸复合体。

作为反应的一个实例，首先，使微小管的氨基与上述化学交联剂的琥珀酰亚胺部分反应，合成出微小管-化学交联剂的复合体，然后使该复合体的马来酰亚胺部分与上述末端被巯基化的核苷酸反应，由此合成出微小管-化学交联剂-核苷酸的复合体(修饰有核苷酸的微小管)。

作为上述化学交联剂，优选使用MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-MBS(间马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯磺酸钠)、SMPB(4-(对马来酰亚胺苯基)琥珀酰亚胺丁酸酯)、Sulfo-SMPB(4-(对马来酰亚胺苯基)琥珀酰亚胺丁酸酯磺酸钠)、GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-GMBS(N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺酸钠)、EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯)、Sulfo-EMCS(N-(ε-马来酰亚胺己酰氧基)琥珀酰亚胺酯磺酸钠)中的任意交联剂。这些化学交联剂的分子量比抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的分子量小两个数量级，约为280Da～460Da，因此单链DNA对微小管的修饰比例(标记率)的设定范围较宽。