[发明专利]坛紫菜幼苗的低温冷藏保存方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种坛紫菜，尤其是涉及一种水产养殖领域的坛紫菜幼苗的低温冷藏保存方法。

背景技术

坛紫菜(Porphyra haitanensis)是我国特有的暖温带性品种，是福建、浙江和广东沿海人工养殖的重要经济红藻，其产量约占全国紫菜总产量的80％。

坛紫菜藻种的低温保存，已有大量的研究，现在对坛紫菜叶状体一般采用先进行阴干处理，后置于-20～-30℃冰箱中冷冻保存的方法，但是在进行坛紫菜遗传育种研究时，经常需要大批量处理每次实验结束后的幼芽或幼苗。由于幼苗比较小且较脆弱，冷冻前的分离和阴干工作比较麻烦、工作量大。而且随着紫菜细胞工程育苗技术的发展，也经常需要保存大量坛紫菜幼苗，以用于后续叶状体的酶解育苗。因此能否采用幼苗带水直接冷藏，并达到与叶状体阴干冷藏相同的效果，已经引起藻类学者的关注。目前，有关紫菜叶状体的鲜活带水冷藏，尚未见过报道。

公告号为CN1565168的发明专利提供一种利用人工诱变、体细胞克隆和单性生殖等选育坛紫菜良种，通过化学或物理人工诱变法获得坛紫菜的变异细胞，用生物工具酶将变异细胞单个分离并将其培养成完整叶状体。依据叶状体的主要光合色素和色素蛋白质含量的高低和它们相互间的比值，游离氨基酸含量高低，生长速度，藻体的厚薄和色泽等指标，筛选出优良突变体叶状体，并将它们再次酶解获得单离体细胞进行再生培养。将获得的幼小叶状体单个分离，培养至大叶状体，利用单性生殖获得纯系丝状体。优良品系的纯系丝状体的F1代叶状体，其优良性状经遗传稳定性分析和综合品质测定后，对优良品系的纯系自由丝状体进行扩增培养，并移植于贝壳内使之成为贝壳丝状体，随后，进行用贝壳丝状体进行大田采苗和养殖试验。经大田试验证明为性状稳定的优良品系，以自由丝状体的方式进行长期保存和推广应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种坛紫菜幼苗的低温冷藏保存方法。

本发明包括以下步骤：

1)配制冷藏保护剂；

2)将冷藏保护剂分装于冻存管中；

3)收集坛紫菜幼苗；

4)将收集到的坛紫菜幼苗置于装有冷藏保护剂的冻存管中；

5)将装有冷藏保护剂的冻存管冷藏。

所配制的冷藏保护剂最好采用盐度为25‰的消毒海水配制，按体积百分比，甘油为10％，二甲基亚砜(DMSO)5％，葡萄糖15％，余为消毒海水。冻存管最好为50ml冻存管。每个50ml冻存管中最好装冷藏保护剂30ml。坛紫菜幼苗最好为1～3cm的鲜活坛紫菜幼苗。所述冷藏最好将装有冷藏保护剂的冻存管密封置于-20～-25℃冰箱中保存。

收集到的坛紫菜幼苗直接置于装有冷藏保护剂的冻存管中即可，无需阴干处理。

当需要复苏时，将装有冷藏保护剂的冻存管置于水浴中解冻，即可取出。取出冻存管中的坛紫菜幼苗，经消毒海水洗涤后，即可进行恢复培养。水浴的温度最好为20℃，水浴中解冻的时间可为15min，消毒海水洗涤的次数最好2～4次。复苏后的坛紫菜幼苗，经恢复培养，低温冷藏180d的鲜活坛紫菜幼苗，存活率仍然可达95％以上。

由于本发明使用冷藏保护剂对坛紫菜幼苗进行鲜活保存，因此避免了常规低温保存时，需对叶状体进行分离、阴干处理等工作，大大节省了工作量，也提高了坛紫菜叶状体低温冷藏的存活率。

具体实施方式

假设在坛紫菜遗传育种时，通过坛紫菜壳孢子的放散、萌发获得了大量坛紫菜幼苗，在无法及时对各株坛紫菜幼苗进行单株培养，以考察各株坛紫菜的经济性状时，即可采用该方法对坛紫菜鲜活幼苗进行低温冷藏。具体步骤如下：

1)用盐度为25‰的消毒海水配制冷藏保护剂，按体积百分比，含10％甘油，5％DMSO，15％的葡萄糖，70％消毒海水；

2)将配制好的冷藏保护剂取30ml，分装于50ml冻存管中；

3)将1～3cm的坛紫菜鲜活幼苗直接置于装有冷藏保护剂的冻存管中；

4)将冻存管密封后，置于-20～-25℃冰箱中保存。

存储一段时间后，需使用这些幼苗时，即可将冻存管从冰箱中取出，进行复苏培养：将冻存管从冰箱中取出，直接置于20℃水浴中解冻；15min后，将冻存管从水浴中取出，经消毒海水洗涤3次，即可置于培养瓶中进行单株培养。保存时间在180d以内的坛紫菜幼苗，存活率可达95％以上。