[发明专利]一种能快速检测外源蛋白表达的光合细菌表达体系及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白表达体系，尤其涉及一种能快速检测外源蛋白表达的表达体系及其 制备方法与应用。

背景技术

大肠杆菌表达体系和酵母表达体系是当今研究得比较成熟并被广泛使用的原核和真核表 达体系，大肠杆菌和酵母成为重组蛋白的理想表达宿主。但利用当前这些表达体系表达目的 蛋白或多肽时，必需首先小量初提目的蛋白，采用SDS-PAGE、Western Blot等常规方法检测 外源目的蛋白是否表达，表达量如何，经上述常规方法分析表明目的蛋白已获得大量表达后， 才大量提取纯化目的蛋白。在这些表达体系内采用现有常规方法检测目的蛋白的表达情况， 操作比较繁琐且耗时。

光合细菌提供了解决上述缺陷的新思路。类球红细菌Rhodobacter sphaeroides是一种革 兰氏阴性光合细菌，属于紫色非硫细菌科红细菌属。它能够以好氧、厌氧、发酵和厌氧光合 作用等多种代谢方式生长，成为研究细菌光合作用的重要的模式生物。在进行光合作用的过 程中，捕光系统2(LH2)吸收光能，然后经捕光系统1(LH1)传递到光化学反应中心(RC)， 在RC中发生电荷分离并经过一系列的电子传递，最后在ADP和ATP合成酶的作用下合成 ATP。

LH2、LH1和RC构成光合细菌的捕光系统，对光合细菌的光合作用及维持其生存起着 重要的作用。研究表明，LH2和LH1是由α/β亚基组成的异质二聚体，α亚基分布在二聚体 的内部，β亚基分布于二聚体的外部。LH2由8或9对α/β亚基组成，而LH1包含16对α/β 亚基，RC的结构和LH2、LH1有所不同，它由H、M、L三个亚基组成。LH2和LH1都能 够非共价地结合细菌叶绿素(BChl)和类胡萝卜素(Crt)，研究发现，LH2中每个α/β亚 基非共价地结合了3个BChl和1个Crt分子，LH1中每个α/β亚基非共价地结合了2个BChl 和2个Crt分子。LH2结合BChl和Crt分子后使得其在800nm和850nm处有特征吸收峰， 而LH1在875nm处有特征吸收峰。BChl分子的主要作用是吸收光能，Crt分子的作用是保护 光合机构免受光氧化作用破坏、驱散多余的辐射能量并有助于维持LH2的结构。

在LH2中α和β亚基大小分别是5.457KDa和6.809KDa，分别由puc操纵子(puc operon) 中的结构基因pucA和pucB编码。此外，puc操纵子中的结构基因pucC能够引导α亚基和β 亚基进入内膜系统，它对α亚基和β亚基正确组装成有功能的LH2起着重要的作用。puc 操纵子的表达受到一系列调控蛋白的调控，如PrrA/PrrB，PpsR/CrtJ，AerR，AppA，FnrL，IHF， TspO等，只有在氧气浓度较低的情况下才能表达。当在合适的氧气浓度下，光合细菌的内膜 会自动凹陷，极大的增加了光合细菌的内膜系统，为膜蛋白的表达提供了大量的空间，为了 填充这些空间，光合细菌puc操纵子中的结构基因pucB、pucA和pucC大量表达，并迅速 在内膜上组装成捕光系统2。光合细菌的这种特性为在其中表达外源蛋白质提供了理论和现 实依据，使其具有开发成为一种新的蛋白质表达体系的潜力，具有极大的应用前景。同时， 在一定的时间范围内，诱导时间越长，光合细菌的特征吸收峰峰值和面积越大，特征吸收峰 的峰值和面积与α和β亚基组装成的LH2的含量相关，即特征吸收峰的峰值和面积间接地表 示了α和β亚基的含量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能快速检测外源蛋白表达的表达体系，它包含表达载体和 目的蛋白的诱导表达及分离纯化两部分，其中表达载体含puc操纵子序列，该puc操纵子包 括结构基因pucB，pucA和pucC。

本发明的优选实施例中，上述的puc操纵子获自类球红细菌。

本发明的优选实施例中，所述的表达载体包括pRK-CH或pRK-AH，目的蛋白基因序列可 以通过限制性内切酶位点Sac I和Xba I连接到上述表达载体上形成目的融合蛋白表达载体， 使其目的蛋白的5’端带有Xa因子，3’末端带有组氨酸标记，便于目的蛋白的分离纯化。

本发明的优选实施例中，所述的表达载体pRK-CH的制备方法在公开号为CN101148679A 的专利申请中描述。