[发明专利]细胞色素P450 BM－3 D168R变体酶以及应用其制备靛玉红的方法

权利要求书

1.一种细胞色素P450BM-3D168R变体酶，其特征在于，该变体酶的核酸序列 为SEQ ID No.1所示。

2.一种应用权利要求1所述的细胞色素P450BM-3D168R变体酶制备靛玉红 的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)设计针对P450BM-3单加氧酶第168位密码子的随机引物，以携带P450 BM-3(F87V/A74G/L 188Q/E435T)变体酶基因的质粒pET28α(+)-P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q/E435T)为模板，进行PCR扩增；

(2)构建突变文库；

(3)筛选催化吲哚的产物中以靛玉红为主的突变体，获得基因的DNA序列为 SEQ ID NO.1的P450BM-3D168R变体酶；

(4)构建表达P450细胞色素P450BM-3D168R变体酶的基因工程菌；

(5)基因工程菌表达细胞色素P450BM-3D168R变体酶；

(6)用表达细胞色素P450BM-3D168R变体酶的基因工程菌全细胞催化吲哚；

(7)分离催化产物，获得靛玉红粗品；

(8)精制靛玉红。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述随机引物 包括上游引物5’-CAGCTTTTACCGANNNCAGCCTCATCC-3’和述下游引物 5’-GGATGAGGCTGNNNTCGGTAAAAGCTG-3’。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，将所述步骤(1) 的PCR产物用DpnI酶解2-5小时后，转化到大肠杆菌，转化液再涂布到含 有30μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上，37℃过夜培养得到突变文库。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)具体为：称取表达 后的基因工程菌，将其悬浮于Tris-HCl缓冲液中，缓冲液pH值为7.0～9.5， 加入吲哚的二甲基亚砜溶液，吲哚终浓度范围为0.5～2mmol/L，在180r/min、 30℃摇床进行反应；反应过程中监测吲哚浓度变化，当吲哚浓度低于 0.5mmol/L时，补加吲哚，直至吲哚浓度不再减少。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲液pH值为8.5，吲哚终 浓度为1.5mmol/L。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中，采用固定化细 胞方法进行催化。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，采用微胶囊包埋方法进行催化。