[发明专利]一种KIM-1检测试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种肾脏疾病的检测方法，尤其是提供了一种应用免疫胶体金技术研制的KIM-1检测试剂盒，同时还公开了其制备方法，属于疾病检测技术领域。

背景技术

急、慢性肾脏疾病是临床常见疾病，其发病率和死亡率都很高，寻找敏感性和特异性的早期肾损伤生物标志物，对早期诊断、治疗和改善预后具有重要意义。本发明涉及的肾损伤分子-1(kidney injury molecule-1，简称KIM-1)是一种新发现的跨膜糖蛋白，在正常肾脏中表达甚微，而在肾损伤时表达明显增加。动物研究表明，KIM-1的外功能区断裂后产物能够通过尿中排出，它可作为人类肾小管损伤的生物标志，因此检测尿中KIM-1水平可以间接评价肾脏损伤的情况。

目前检测KIM-1的方法包括免疫组化、ELISA、Western blot等，可用于科学研究，但用于临床则存在很多弊端，如操作程序复杂，时间较长等。

发明内容：

本发明公开一种KIM-1检测试剂盒，用于诊断肾脏疾病。

本发明还提供了KIM-1检测试剂盒的制备方法，适用于工业化生产。

本发明提供的KIM-1检测试剂盒，在硝酸纤维素膜的两端分别设有金标垫和吸收垫，金标垫上端为样品垫，金标垫包被有纯化的KIM-1抗体胶体金偶联标记物，检测线包被有纯化的KIM-1抗体，质控线包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线侧贴有吸收垫。

本发明KIM-1检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

本发明根据抗原抗体能特异结合的免疫学基本原理，将纯化的KIM-1抗体用胶体金标记，喷点于玻璃纤维膜上制备成金标垫，将纯化的KIM-1抗体和正常抗小鼠IgG抗体分别包被在硝酸纤维素膜(NC膜)上的检测线处和质控线处，当被检样品中含有KIM-1抗原时，则于金标垫与胶体金标记的KIM-1抗体结合，并在吸收垫的作用下，向前渗透泳动，与检测线上的KIM-1抗体再次结合，出现肉眼可见的色带。

本发明试剂盒的使用方法如下：取尿标本约0.5ml加入小试管中，然后插入试纸条，待1-2分钟反应带清晰后观察结果(见图2)。出现1条红色(对照)沉淀线，为尿检诊断阴性；出现2条红色(样品和对照)沉淀线，为尿检诊断阳性，未出现沉淀线则为无效。

本发明的积极效果在于：首次应用免疫胶体金技术制备KIM-1检测试剂盒，并拟应用于临床，以推动KIM-1在临床的广泛应用，提高对肾脏疾病的防治能力，可以快速，灵敏检测特定蛋白，避免了复杂的操作，无需特殊检测仪器，结果易于观察判断，可以适应多种检测环境，以及多种检测需要。并且检测结果可以长期保存，便于对照分析。可用于肉眼水平的免疫检测，样本用量极小，对操作者无毒性，对环境无污染等。因此应用胶体金技术研制KIM-1检测试剂盒具有重大的社会意义和广阔的市场前景。

附图说明

图1.KIM-1检测装置示意图；

1.样品垫；2.金标垫；3.硝酸纤维素膜；4.吸收垫；5.检测线；6.质控线。

图2.KIM-1试剂盒检测结果判定。

图3为胶体金颗粒的制备流程图；

图4为免疫胶体金的纯化流程图。

具体实施方式

通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。

实施例1

根据图1所示，KIM-1检测试剂盒由经过处理的样品垫1、金标垫2、硝酸纤维素膜3、检测线5、质控线6和吸收垫4组成，其中，金标垫2包被有纯化的KIM-1抗体胶体金偶联标记物，检测线5包被有纯化的KIM-1抗体，质控线6包被有正常抗小鼠IgG抗体，质控线6侧贴有吸收垫4。

实施例2

1、胶体金颗粒的制备：取1％氯金酸溶液1ml加99ml超纯水成终浓度0.01％的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1％柠檬酸三钠1.6ml一次性迅速加入煮沸的氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积(见流程图)。在透射电镜下观察，可见金颗粒大小基本一致，分布均匀。测量100个胶体金颗粒直径，计算平均直径约20nm。

胶体金颗粒的制备流程图：见图3.