[发明专利]以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫基因重组活疫苗生产工艺及制品

说明书

技术领域

本发明提供一种以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫基因重组活疫苗的生产工 艺及制品，用于家畜(牛、羊)日本血吸虫病的预防和治疗，属于动物传染病疫苗制备 技术领域。

背景技术

日本血吸虫病是一种严重危害人类健康、影响经济和社会发展的人兽共患寄生虫 病，除感染人外，还能感染牛、羊等家畜，给畜牧业造成重大经济损失。只靠药物治疗 还不能解决人畜重复感染的问题。因此，研制动物血吸虫疫苗是控制和消灭血吸虫病的 重要基础和技术保障。

现代分子生物学及免疫学技术的发展，使血吸虫疫苗的研究已由死疫苗、减毒活疫 苗等传统疫苗发展到了核酸疫苗、基因工程疫苗等新型疫苗。日本血吸虫传统疫苗虽然 诱导的保护力高，但缺乏足够的虫种资源，且存在安全、贮藏及运输等问题，未能得到 实际运用。

血吸虫虫体大，抗原复杂，至今用单一一种基因工程苗诱导的免疫保护效果都不 够理想。进一步分离、鉴定一些与血吸虫生长、发育相关的保护性抗原基因，探讨多 价混合疫苗(Cocktail vaccine)、多表位基因工程疫苗的免疫协同作用，是提高疫苗 免疫保护效果的有效途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种以猪伪狂犬病病毒为载体的日本血吸虫免疫预防用的基 因重组活疫苗，用于家畜(牛、羊)日本血吸虫病的预防和治疗。

本发明还公开了上述基因重组活疫苗的生产工艺，适用于工业化生产。

本发明的日本血吸虫基因重组活疫苗是以伪狂犬病病毒为载体，日本血吸虫保护性 抗原基因为目的基因的病毒活载体疫苗。通过同源重组的方法利用日本血吸虫保护性抗 原基因表达盒取代伪狂犬病病毒复制非必需基因TK、PK、gG或gI，其中目的基因表达 单元含有巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚A(poly A)信号结构。

本发明的基因重组活疫苗的生产工艺包括以下步骤：

A.日本血吸虫保护性抗原基因的克隆：通过RT-PCR或人工合成的方法获得保护性 抗原全长基因或含有抗原表位的序列，如Sj26GST、FABP、Sj23等。

B.重组质粒的构建：首先将日本血吸虫保护性抗原基因克隆入真核表达载体pVAX1 或pIRESneo中。

a.将Sj26GST基因克隆入真核表达载体pVAX1构建重组质粒pVAX/Sj26GST；

b.将血吸虫FABP基因克隆入pVAX/Sj26GST构建重组质粒pVAX/Sj26GST-FABP；

c.将经步骤c获得的重组质粒pVAX/Sj26GST-FABP中的Sj26GST-FABP基因亚克隆 入真核表达载体pIRESneo的多克隆位点，构建重组质粒pIRES/GF，在此基础上，将血 吸虫Sj23基因克隆入pIRES/GF的XbaI/SmaI位点，替代该位点的Neo基因，构建重组 质粒pIRES/GF23；

d.提取伪狂犬病毒基因组DNA，用限制性内切酶(AscI)或PCR的方法获获得含有 完整TK、PK、gG或gI的片段，将此片段克隆入pPolyII的多克隆位点，构建中间转移 载体p8KD；

e.将上述经a、b、c、d步骤构建的重组真核表达载体含有日本血吸虫保护性抗原 基因的表达单元，其特征在于含有巨细胞病毒(CMV)启动子和多聚A(poly A)结构， 克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，构建成重组中间转移载体；

f.将lacZ基因表达单元克隆入中间转移载体p8KD的适宜酶切位点，构建成重组 中间转移载体p8KD/lacZ；

C.重组中间病毒rPRV/LacZ的获得：将重组中间转移载体p8KD/lacZ与伪狂犬病 毒的基因组DNA经脂质体共转染Vero细胞，在X-gal存在时经蓝白斑筛选，获得 rPRV/LacZ；

D.重组病毒的获得：提取重组中间病毒PRV/LacZ的基因组，经限制性内切酶EcoRI 酶切后与上述e构建的重组中间转移载体共转染Vero细胞，在X-gal存在时经蓝白斑 筛选、PCR及IFA鉴定获得日本血吸虫重组活载体疫苗；

E.疫苗的制备：将上述D构建的重组病毒以Vero细胞增殖后，加入保护剂，并按 国家有关要求制成冻干制品。

本品为淡黄色中性冻干制剂，