[发明专利]高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法，具体涉及的是由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，由阳离子磷脂形成双分子层结构继续赋予该基因载体穿透细胞膜的功能，并通过聚二乙醇(PEG)分子稳定粒子结构，形成物化性质稳定、生物兼容性好的基因传递系统。本发明主要应用于：A、DNA质粒的转染试剂；B、肿瘤治疗用基因治疗药物的制剂；C、用于反义核酸和siRNA(RNA干扰)转染试剂；D、制备反义核酸和siRNA(RNA干扰)治疗用的药物制剂。

背景技术

已经上市的重组人肿瘤抑制基因(p53)腺病毒注射液，商品名：今又生，采用腺病毒，但其本身存在不可避免的安全性问题，如表达外源基因时间短，免疫原性强，易引发强烈的炎症反应和免疫反应，毒性较大等缺点。2000年，宾州大学有病人在基因治疗使用病毒载体中死亡，2002年在法国又发生先天免疫不全症基因治疗临床试验发生白血病的副作用。这两件失败的案例皆被归因于病毒载体的不安全性。因此，开发全新的非病毒载体迫在眉睫。

厦门太阳马生物工程公司对DNA转染试剂有过研究，它的主要成分是阳离子脂质体的聚合物，但由于其产品毒性高，转染效率低而不能为市场所接受。

美国INVITROGEN公司的各种系列的基因载体。大部分采用的是阳离子脂质体和中性磷脂为基本材料，毒性很高。

基因载体是指将基因或其它核酸物质运载到细胞中的工具。其化学本质可以是蛋白质或多肽、核酸、脂类、糖类、其它有机分子或它们的复合物。载体在生物技术中具有不可或缺的作用。根据载体的组成和制备过程可将基因载体分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体是将外源基因包装到天然病毒的外壳中，利用病毒对宿主细胞的感染性将外源基因导入细胞中。病毒载体因具有转导效率及表达效率高的特点而得到广泛应用。目前常用的病毒载体有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体等。非病毒载体是将外源基因用各种人工的或天然的材料包装起来形成的″人工病毒″。用于制备″人工病毒″的材料主要包括核酸、脂质和蛋白质，还可以偶联各种其它化学成分。基因载体是基因药物的重要组成部分，也是目前基因治疗的瓶颈。病毒载体尽管效率高，但是病毒载体的安全性问题限制了它的应用。非病毒载体具有安全、易于制备等优点，将来人们更乐于选择非病毒载体。

发明内容

本发明的目的提供一种高分子聚合物构建的新型基因载体及制备方法，该基因载体综合了最常用阳离子聚合物和脂质体两种非病毒载体的优点，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，由阳离子磷脂形成双分子层结构继续赋予该基因载体穿透细胞膜的功能，并通过PEG分子稳定粒子结构，形成物化性质稳定、生物兼容性好的基因传递系统，适合作为体内外基因传递的载体。

本发明的作用机理

主要有带负电荷的基因和带正电荷的阳离子脂质体和阳离子聚合物组成，阳离子聚合物与带负电荷的基因及带正电荷的阳离子脂质体形成稳定的胶体复合物，如图1所示。相对于高分子聚合物复合体(polyplexes)和磷脂复合体(lipoplexes)，磷脂聚合物复合体(Lipopolyplexes)具有转染效率提高、毒性降低、稳定性更好等特点。阳离子聚合物有助于核酸压缩聚集，以便通过胞膜，而脂质体部分则使整个磷脂聚合物复合体更加稳定，并有效介导细胞内化后载体的内涵体逃逸，提高转染效率。

本发明的技术方案为：

高分子聚合物构建的新型基因载体，由交联的阳离子聚合物形成水性核心结构，再与阳离子脂质体形成双分子层结构，并通过聚二乙醇分子稳定粒子结构。交联的阳离子聚合物与阳离子脂质体按0.5-2∶1的比例，以疏水作用力形成双分子层结构，聚二乙醇又通过和磷脂共价结合的方式被安插在双分子层结构外层，从而使整个纳米粒子具有聚二乙醇化的外包膜，其理化稳定性在聚合物复合体和磷脂复合体基础上得以提高。其中阳离子聚合物为聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖、或聚甲基丙烯甲酯，阳离子脂质体为N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基硫酸铵(DOTAP)或N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-二甲基硫酸铵(DODAP)。

新型基因载体的制备方法，按以下步骤进行：

(1)阳离子聚合物的制备方法为：以分子量1000-5000的聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚乙烯亚胺、聚丙烯亚胺、壳聚糖或聚甲基丙烯甲酯进行巯基化修饰后自发反应形成生物可降解的分子量为1万-50万阳离子聚合物，控制交联的修饰度在50％，带电量控制在+50mV、形成亲水的凝胶结构；