[发明专利]一种氟苯尼考类药物快速检测试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测分析动物源性食品中兽药残留的技术，特别是快速检测氟苯尼考类药物的酶联免疫试剂及方法。

背景技术

氟苯尼考又称氟甲砜霉素(Florfenicol，FF)，是甲砜霉素(TAP)的衍生物。由于其对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等作用明显且价格低廉，因此被广泛应用于各类家禽、家畜、水产养殖业及蜂产品的各种传染性疾病的治疗，但研究发现其对鱼类的免疫活性有抑制作用，对哺乳动物具有胚胎毒性，氟苯尼考代谢物还与氯霉素存在交叉反应。因此联合国食品法典委员会(CAC)和许多国家规定食品中氟苯尼考(FF)的残留量不得超过0.1ppm，欧洲经济区规定检测限为1ppm，日本限量检出限为0.1ppm，我国限量检出1ppm。

氟苯尼考目前一般采用HPLC或LC/MS，但这类方法样本前处理及测定操作烦琐，检测所需时间较长，检测费用高，推广使用受到限制。因此加强对氟苯尼考药物残留检测技术的研究势在必行。

发明内容

本发明的检测原理：当包被原为氟苯尼考偶联抗原时是将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白偶联物(FF-OVA)吸附于固相载体上，加入样本或氟苯尼考标准品，然后加氟苯尼考特异性抗体，待测样品中残留的氟苯尼考和酶标板上包被的氟苯尼考抗原竞争氟苯尼考特异性抗体。再加入酶标记抗抗体进行酶活性的放大作用，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氟苯尼考残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考的浓度。

包被原为抗抗体时是将抗抗体吸附于固相载体上，加入氟苯尼考特异性抗体，再加入氟苯尼考酶标记抗原和样本或氟苯尼考标准品溶液，待测样本中残留的氟苯尼考和酶标记氟苯尼考抗原竞争氟苯尼考特异性抗体，显色后终止，测定样品的吸光度值，该值与样品中氟苯尼考残留量呈负相关，与标准曲线比较即可得出氟苯尼考的浓度，与标准溶液颜色比较则可判断样品中氟苯尼考的浓度范围。

本发明提供了一种检测动物源性食品中氟苯尼考的酶联免疫试剂盒，它含有：

(1)包被氟苯尼考抗原的酶联板或包被抗抗体的酶联板；

(2)酶标记物；

(3)氟苯尼考特异性抗体；

(4)氟苯尼考标准品溶液；

(5)底物显色液；

(6)终止液；

(7)浓缩洗涤液；

(8)浓缩复溶液。

本发明所述试剂盒中氟苯尼考包被抗原是采用混合酸酐法将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)进行偶联得到的，抗抗体可为羊抗鼠抗抗体或羊抗兔抗抗体，羊抗鼠抗抗体是以鼠源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到，羊抗兔抗抗体是以兔源抗体为免疫原对无病原体山羊进行免疫得到。制备酶联板过程中所用的包被缓冲液为批pH值9.6、0.05mol/L的碳酸盐缓冲液；包被氟苯尼考抗原或抗抗体的载体物质可为聚苯乙烯、纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、玻璃、硅橡胶、琼脂糖凝胶等；载体的形式可以是试管、微量反应板凹孔、小珠、小圆片等；所用的洗涤液为含有0.1％～0.5％吐温80，0.5％叠氮化钠(NaN₃)防腐剂的磷酸盐缓冲液；所用的封闭液是含有8％～15％的脱脂奶和1％惰性蛋白的溶液。

本发明所述试剂盒中包被氟苯尼考抗原的酶联板或包被抗氟苯尼考抗体的酶联板的制备步骤为：

(1)用包被缓冲液将氟苯尼考半抗原与鸡卵清白蛋白(OVA)偶联物或抗抗体以0.02～0.08μg/ml浓度稀释成抗原稀释液或抗抗体稀释液；

(2)向酶联板的每孔中加入100μl已经稀释好的抗原稀释液或抗抗体稀释液，37℃温育6h，倾去包被液，用洗涤液洗涤4次，每次15～30s，拍干；

(3)向酶联板的每孔中加入150～200μl封闭液，37℃温育1～2h，倾去孔内液体，干燥后用铝膜真空密封保存。

以上方法制备的酶联板具有很好的稳定性，经过冷热稳定性试验，酶联板的相关技术参数均在正常范围，且包被原有良好的特异性。

本发明所述试剂盒中酶标记物为酶标记抗抗体或酶标记氟苯尼考抗原，所用酶可为过氧化物酶或半乳糖甘酶，本发明优选过氧化物酶；酶标记物形式可为冻干粉、浓缩液和工作液；酶标记物工作液所用的稀释液为含有50％甘油(可防止放入-20℃环境的酶标记物冻结，亦可长时间保持酶标记物的生物活性)、1％的叠氮化钠防腐剂(便于保存)的溶液。

本发明所述试剂盒中酶标记抗抗体的制备步骤为：