[发明专利]抗家畜口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属遗传工程技术领域，具体涉及一种抗家畜口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗及其制备方法。

背景技术

国际兽疫局将口蹄疫(Foot-and-mouth disease)列为A类传染病之首。家畜口蹄疫是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。预防接种是控制该病毒的主要手段。在各种预防口蹄疫的疫苗中，基因工程疫苗由于安全性好，易于保存，效果稳定等优点具有广阔的应用前景。

与口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)免疫原性密切相关的是其外壳蛋白VP1基因，该蛋白中含有口蹄疫病毒主要抗原表位。目前较为成熟的口蹄疫病毒基因工程疫苗，即将口蹄疫病毒主要抗原表位与一个大分子载体蛋白相连，构成一个融合蛋白，进而有效地诱导动物产生免疫应答。但是现有的基因工程疫苗仍然存在一些问题需要解决，如需要二次免疫问题。

发明内容

本发明的目的是在基因水平上改进原有疫苗，提出一种高效、安全可靠的口蹄疫病毒多肽疫苗及其制备方法。

本发明提出的口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，是以截短的β-半乳糖苷酶作为抗原载体蛋白，口蹄疫病毒抗原多肽连接在该载体蛋白的C末端而构成的融合蛋白；其中，口蹄疫病毒的抗原多肽由T helper刺激因子序列(简称Th序列)和2个抗口蹄疫病的作用单位中的一个重复串联组成，每个作用单位由口蹄疫病毒VP1蛋白中多个具有抗原性的氨基酸肽段串联组成，在各个氨基酸肽段连接处有氨基酸多肽作为接头。

为了保证抗原表位能够更好地诱导动物机体的免疫应答，必须加入一定的载体蛋白组成融合蛋白，β-半乳糖苷酶全长基因一直被认为是较好的选择。但是载体基因太大，无形中降低了抗原表位基因在融合基因中的比例，相应地也降低了目的蛋白在融合蛋白中的含量，势必对免疫原性造成一定影响。本发明中，将pWR590中β-半乳糖苷酶的590个氨基酸，截短310个氨基酸后，作为新载体pWR280，记为SEQ.ID.NO.1，抗原多肽连接在该载体的C-末端。实验表明，以pWR280作为载体蛋白而构建的抗口蹄疫病毒基因工程多肽疫苗，比以pWR590为载体蛋白构建的多肽疫苗，具有更好的免疫效果。

本发明中，口蹄疫病毒VP1蛋白中具有抗原性的氨基酸肽段是指VP1蛋白中21～40、141～160、200～213位氨基酸肽段(分别表示为：VP1(21-40)、VP1(141-160)、VP1(200-213))，并且可以前后浮动适当个数的氨基酸残基，如采用35～51、134～158、141～158、135～144、188～209位氨基酸肽段(分别记为：VP1(35-51)、VP1(134-158)、VP1(141-158)、VP1(135-144)、VP1(188-160))；口蹄疫病毒抗原表位中的氨基酸序列部分具有保守性，如141～160中RGD位点，而非保守部分以流行株序列为依据；通常21～40AA可替代1-2个氨基酸；141～160AA可替代1-5个氨基酸；200～213AA可替代1-3个氨基酸，其原则是这些氨基酸肽段均具有抗原性。

将VP1(21-40)或者其中浮动适当个数氨基酸残基的肽段，记为X；将VP1(141-160)或者其中浮动数适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Y；将VP1(200-213)或者其中浮动数适当个数的氨基酸残基的肽段，记为Z。每个作用单位可以由X、Y、Z所代表的肽段中任何两个肽段经重复串联组成，例如X-Y-X，X-X-Y，Y-X-Y，Y-Y-X，Y-Z-Y，Y-Y-Z，Z-Z-Y，Z-Y-Z，X-Z-X，Z-X-Z，Z-Z-X或X-X-Z等，肽段连接处有一些氨基酸多肽作为接头。如在具体实施例中，上述序列组成141～160AA-21～40AA-141～160AA的串联结构作为一个作用单位。并在141～160AA-21～40AA-141～160AA的抗原多肽结构中，肽段连接处加入一些氨基酸多肽作为接头，如后述实施例中采用前后两个接头分别是2个和11个氨基酸，其中前一接头的2个氨基酸为Pro-Gly，后一接头的11个氨基酸为Gln-Phe-Glu-Leu-Glu-Phe-Met-Val-Pro-Ser-Arg。

本发明中，所述的抗原多肽的结构为P-T-P，这里P为一个作用单位，T为Th序列，Th序列与作用单位P之间也加有氨基酸多肽接头。在实施例中，在Th序列的两侧加入的接头，分别是D(Leu-Lys)和E(Lys-Leu)两个二肽接头。