[发明专利]提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置

说明书

技术领域

本发明与生物医学有关，涉及双光子荧光成像，特别是一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法和装置，以适用于医学中对生物组织内部的检测。

背景技术

随着生物医学领域的快速发展，人们对显微成像技术提出了越来越高的要求，不仅需要对物体表面形貌和光学特性进行分析，而且更需要对它内部的构造进行三维观察与处理，这就需要提高成像深度。

近年来，双光子激发荧光成像引起了人们广泛的兴趣(Denk W，Strickler J，Webb W.，Science，Vol.248，73～76，1997)。双光子激发(以下简称为TPE)是一种三阶非线性过程，这种非线性的特点，使得双光子激发需要更高的激发功率，并且荧光信号的强度与激发光强度的平方成正比，从而能够将双光子荧光的产生局域在焦点区域。因此双光子成像具有天然的对三维样品层析成像的能力。据报道，利用锁摸掺钛蓝宝石振荡器作为激发光源能实现的最大层析深度为600μm(参见Kleinfeld D.，Mitra P.P.，Helmchen F.，Denk W.，Proc.Natl.Acad.Sci.Vol.95，15741，1998)。2003年，Denk等人使用掺钛蓝宝石的再生放大器作为双光子荧光激发的光源，对小鼠大脑的在体层析深度达到1000um，即1mm(Theer P.，Hasan M.T.，Denk W.，Opt.Lett.，Vol.28，1022～1024，2003)。进一步提高层析深度将对生物医学研究有非常大的意义。在高散射介质中，激发光的强度随着深度的增加呈指数衰减，为了在更深处维持同样的信号强度，激发光强度需随深度指数增加。但随着激发光能量的提高，焦点之外区域的荧光发射也大大增强，这就不可避免地引起了背景信号的增强，因此导致成像对比度的降低，从根本上限制了层析深度的提高。

双光子激发时，两束光的波长不一定必须相等，两束不同波长光激发的双光子过程称为双色双光子激发(以下简称为TCTPE).双色双光子激发与双光子激发具有相同的物理机制，两个激发波长需要满足1/λ_e＝1/λ₁+1/λ₂，其中：λ_e为单光子激发波长，λ₁和λ₂为两个激发波长。TCTPE荧光信号的强度I_TC∝I₁(λ₁)I₂(λ₂)。TCTPE与TPE的最大区别是其在成像中的光学特性不同，TCTPE的两束激发光具有不同的波长，属于非相干激发，而TPE是相干激发过程。对于TCTPE，只有两束光交迭区域才能激发荧光，两束光非相干叠加，旁瓣要小的多，因此相对于TPE的信噪比更高。在典型的双色双光子方案中，两种不同波长的光成一定的角度入射，分别用两个物镜将两束光聚焦于样品中的同一点激发荧光。两束光在焦点前后在空间上是完全分开的，只在焦点区域重叠，因此只有焦点区域能够激发双色双光子荧光，背景噪声非常小。在高散射介质中，指数增加激发光强以维持更深处TCTPE荧光信号时，不会引起背景信号的大量增加。因此，双色双光子比双光子成像有较高的信噪比，层析深度更深。但该方案也有其不足之处：

(1)由于使用两个物镜，调节较困难；

(2)物镜之间成一定的角度，这缩短了物镜的有效工作距离；

(3)不容易对活体组织进行观测。

如何寻找一种合适的方案来提高层析深度是目前光学显微成像领域面临的重要问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服上述现有对生物组织深度层析成像方面的不足，提供一种一种提高层析深度的双色双光子荧光成像方法和装置，该发明可提高高散射介质中三维成像的层析深度，有效地消除背景荧光，提高信噪比，而且操作方便。

本发明的技术解决方案如下：

一种提高双色双光子荧光成像层析深度的方法，其特点是采用外光束包含内光束且同轴的双色光通过同一个聚焦物镜聚焦到样品中激发样品荧光的方法，内部光束为一圆形光束，波长为λ₁，半径为r₁，外部光束为一圆环形光束，波长为λ₂，内径为r₁，外径为r₂。

一种双色双光子荧光成像装置，其特点在于该装置包括照明部分、探测收集部分和扫描部分：

照明部分包括：