[发明专利]聚阳离子纳米脂质载体系统及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种新型的非病毒基因给药载体，具体涉及一种聚阳离子纳米脂质载体系统及其制备方法。

背景技术

基因治疗技术已经成为目前国内外生物医药研究的热点领域之一，该技术应用的关键是需要一种安全、高效的基因给药载体系统。目前，基因给药载体主要分为病毒载体和非病毒载体。其中，病毒载体具有非常高的转染效率，是目前临床上应用最为广泛的一种基因给药载体，但是病毒载体本身具有很强的免疫原性，有潜在的与宿主细胞整合的危险性，而且缺乏靶向性，所存在的缺点严重影响了该类产品的临床应用，如1999年美国重组腺病毒“Jesse Gelsinger”事件和2000年法国发生的逆转录病毒诱导白血病恶性事件等；因而，近年来非病毒基因给药载体的研究备受关注。

目前使用的非病毒基因给药载体主要有阳离子脂质体(Dalby B，Cates S，etal.Methods，2004，33：95-103)，阳离子聚合物(Boussif O et al.Proc Nat AcadSci USA，1995，92：7297-7301)和纳米粒(Hu FQ，et al.Inter J Pharm.，2006，315：158-166.)等。其中，阳离子脂质体是目前应用最多最为广泛的一种非病毒基因给药载体，其主要由阳离子的磷脂和中性磷脂DOPE二者组成，具有较高的体外转染效率，但是有血浆存在时，转染效率则急剧降低，不能用于体内的基因转染，严重限制了其临床应用，而且该载体毒性较强；阳离子聚合物是目前研究较多的另外一种非病毒基因给药载体，如聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)，树状大分子(PAMAM)以及聚赖氨酸(PLL)和其他的聚阳离子蛋白质如鱼精蛋白等，该类基因给药载体也具有较高的体外转染效率，并且能够促进质粒向细胞核内的转运，可用于体内的基因转染，但同样存在毒性较强，而且很容易聚集的缺点；纳米粒能够克服组织的障碍，具有良好的细胞摄取效果，能够将质粒DNA导入细胞浆内，但转染效率较低。

阳离子脂质体具有较高的转染效率，原因是其中的成分DOPE进入细胞后，在内吞泡中在酸性pH条件下，形成六角形的H_II相，使得内吞泡破裂，从而避免了质粒DNA的降解；阳离子聚合物主要是由于其在酸性条件下，其中的氨基带有正电荷，引起离子的内流，即“质子海绵”作用从而使内吞泡破裂，而且该类聚合物能够促进质粒DNA往细胞核内的转运；纳米粒则具有良好的细胞摄取效果。有研究表明油酸类物质如三油酸甘油酯(TO)，二油酸甘油酯(DO)单油酸甘油酯(MO)和油酸(OA)能够促进磷脂形成H_II相。

发明内容

本发明的目的是提供一种非病毒基因给药载体，具体涉及一种聚阳离子纳米脂质载体系统。

本发明在该载体系统中引进油酸类物质制备一种新型的非病毒基因给药载体。在国家973项目基金(No.2007CB935800)的支持下制备了聚阳离子纳米脂质载体系统(Polycation nanostructured lipid carrier，PNLC)。

本发明聚阳离子纳米脂质载体系统由烷基化聚乙烯亚胺、磷脂和类脂类物质组成，其中，烷基化聚乙烯亚胺与磷脂的摩尔比为0.05～2∶1，类脂类物质与磷脂的摩尔比为0.2～6∶1。

所述的聚阳离子纳米脂质载体系统，具有较高的体外细胞转染效率，可作为一种非病毒基因给药载体。

本发明聚阳离子纳米脂质载体系统采用磷脂、类脂类物质和阳离子的烷基化PEI制成，其中所述的磷脂和类脂类物质形成疏水性的纳米脂质内核结构，所合成的烷基化PEI具有疏水性的烷基端和亲水性的阳离子PEI，具有双亲性的性质，在制备过程中烷基化PEI通过疏水端的十六烷基与纳米脂质内核结合，从而将阳离子的亲水端的PEI锚定在纳米脂质载体的表面形成阳离子化的纳米脂质载体，使其表面具有阳离子的特征，可以通过静电结合的作用与带有负电荷的质粒DNA结合。上述非病毒基因给药载体同时具有阳离子聚合物PEI、脂质载体和纳米给药系统的特征，从而能够更好地作为基因类药物的非病毒类给药载体，而且该系统采用了小分子量的PEI以降低载体系统的毒性，所述的类脂和磷脂成份具有较好的生物相容性，因而该系统具有较低的毒性。

本发明所述的烷基化聚乙烯亚胺采用溴化十四烷、溴化十六烷和溴化十八烷分别与聚乙烯亚胺600Da，聚乙烯亚胺1200Da，和聚乙烯亚胺1800Da反应，合成制备烷基化聚乙烯亚胺；