[发明专利]提取隐藏嗜酸菌胞内聚－β－羟基丁酸酯的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)提取聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的方法。

背景技术：

聚-β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyrate，简称PHB)是细菌细胞内积累的一种高分子聚合物，是生物降解塑料的重要原料。由于它在具有一般化学合成塑料特性的同时，还具有生物可降解性、生物相容性和利用再生资源进行生物合成的特性，得到国际生物工程界的广泛重视。PHB的提取成本是影响其大规模工业化生产的一个重要因素，因此研究和探索PHB的提取方法，是当前迫切需要解决的问题。沈忠耀等报道目前PHB的提取方法，主要包括次化学试剂、有机溶剂法、机械破碎法以及酶法等。其中机械破碎法和酶法的提取率比较低，一般低于30％。前两种提取方法用的比较多，而化学试剂法中的次氯酸钠法是目前最常用的方法，其优点是简单、快速，但易引起PHB分子的严重降解。Hahn等对次氯酸钠法进行了改良，用分散的次氯酸钠溶液/氯仿从菌体中提取PHB，发现PHB提取率有明显提高而且摩尔质量的下降程度明显减弱。目前PHB提取方法研究的对象一般是真氧产碱杆菌。

发明内容：

为了提高隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞内聚-β-羟基丁酸酯的提取效率，本发明做了一系列的研究工作，提供了一个有效提取该属菌的PHB方法。

自然界中的隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)一般存在于酸性矿坑水中，与生物浸矿密切相关。该菌的16S rRNA基因序列己登录于Genbank，登录号为DQ168464。其保藏号为：CCTCC NO：M 208056。该菌既可以氧化低价态硫获取能量进行自养生长，又可以利用有机质进行异养生长。同时，发现该菌异养生长时，不仅生长迅速，而且胞内能产生大量聚合物颗粒，该聚合物经红外和紫外光谱检测证实为PHB，具有进一步开发成PHB新型生产菌的潜力。然而，提取隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞内聚-β-羟基丁酸酯(PHB)的方法的研究工作开展的较少，因此要实现隐藏嗜酸菌生产PHB的工业化，对其提取工艺进行研究是必不可少的。

隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)胞内聚-β-羟基丁酸酯的提取方法，首先对隐藏嗜酸菌进行超声破碎，超声破碎工作2s，间隔4s，工作10～30次，再用pH为10、体积比为2∶1～1∶2的次氯酸钠溶液/氯仿抽提，最后在4℃加入乙醇，得沉淀即PHB。

本发明采用超声/次氯酸/氯仿提取PHB，胞内PHB提取率可以达到88％。

具体实施方式：

实施例1

1.菌种的培养与收集

将Acidiphilium cryptum菌DX1-1菌株培养至对数生长中期，10000r/min离心10min收集菌体，用无菌水(pH3.0)清洗菌体2次。将沉淀菌泥用20mL无菌水重悬。

2.超声破碎

将装有菌液的离心管，放在预先放有冰块的烧杯里，按如下程序超声破碎：工作2s，间隔4s，工作10～30次。

3.分散的次氯酸钠溶液/氯仿提取PHB

超声破碎后的液体中加入80mL体积比为2∶1～1∶2的次氯酸钠溶液(pH10)/氯仿，30℃摇床震荡60min后，8000r/m离心分为三层上层次氯酸钠溶液，中层未破壁细胞以及非PHB细胞物质，下层PHB氯仿溶液。抽取氯仿相缓慢加入50mL乙醇，4℃放置30min使充分沉淀。10000r/m离心，弃上清，沉淀乙醇洗涤两次，60℃干燥。

4.提取结果的验证

不同提取方法提取隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞内PHB的效率

不同方法提取PHB效果验证

超声/次氯酸纳/氯仿提取隐藏嗜酸菌(Acidiphilium cryptum)菌DX1-1胞内PHB效果验证

超声/次氯酸纳/氯仿提取PHB效果验证

其中先用超声破碎(工作2s，间隔4s，工作20次)，再用体积比为1∶1的次氯酸钠溶液(pH10)/氯仿抽提，最后用乙醇(4℃)沉淀的提取方法最适合Acidiphilium cryptum菌胞内PHB的提取。