[发明专利]基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器及其免疫检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及微间隙电极阵列免疫传感器件的制备及其免疫检测方法。

背景技术

免疫分析是生物医学分子检测最常用的技术之一，对于病原体(致病菌、病毒)、疾病标志物、药物与化学生物毒素等的快速筛查与检测具有极其重要的意义，是临床诊断、医学研究、食品与公共安全、药毒物分析、环境监测等领域主要的研究工具。目前较为普遍使用的免疫分析技术主要是酶联免疫法、荧光免疫法、金标侧流免疫层析法等。这些检测方法灵敏度不高，难以实现早期疾病的诊断与研究，且这些方法大都需要使用精密仪器进行定量分析，不适宜现场快速检测的需求。

发明内容

本发明的目的在于克服传统免疫分析技术灵敏度低、需精密仪器定量检测的不足，提出一种基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器及其免疫检测方法，具有高灵敏、快速、低成本的特点。

本发明的技术方案之一是，所述基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器采用微间隙阵列金电极做基片，并采用以下步骤制得：

1、取常规光刻印刷法制作的微间隙阵列金电极做基片，它为叉指式双电极，正负电极均为两个梳形金电极，彼此交叉组成微间隙阵列金电极。梳形齿D₁宽为1μm-100μm，间隙D₂为1μm-100μm；

2、微间隙阵列金电极的硅烷化处理，其步骤是：

a.将所述微间隙阵列金电极用无水乙醇清洗三次，每次1min；

b.将该电极浸入1M的NaOH溶液中，静置28min-32min；

c.用超纯水清洗该电极三次，每次1min；吹干；

d.将该电极浸入含氨丙基三甲氧基硅烷5％(体积百分数)的乙醇溶液中，室温下静置23小时-25小时；

这样可在微间隙阵列金电极间的基片上形成一氨基硅烷自组装单层；

e.用超纯水清洗三次，吹干，获得硅烷化的微间隙阵列金电极；

3.免疫传感器的制备步骤：

a.将所述硅烷化的微间隙阵列金电极浸入质量分数为5％的戊二醛水溶液，室温下静置0.8小时-1.2小时，再用超纯水清洗三次；

b.在所述电极上滴加30μL待测物的鼠单克隆或羊多克隆抗体溶液，抗体浓度为100μg/mL，室温下静置反应0.8小时-1.2小时；这样使得抗体通过戊二醛交联剂固定在微间隙阵列金电极的基片上；所述鼠单克隆或羊多克隆抗体溶液是将所述抗体溶于0.01M、pH7.4磷酸缓冲溶液而得；

c.用超纯水清洗所述电极三次，吹干，得到免疫传感器；保存于4℃备用。

本发明的技术方案之二是，采用上述基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器检测有碱性磷酸酶标记的单克隆抗体的分析物方法采用以下步骤：

1.将分析物样品或标样溶液(该分析物样品或标样溶液溶是将所述分析物样品或标样溶于0.01M、pH7.4磷酸缓冲溶液而得)、碱性磷酸酶标记鼠单克隆抗体溶液(该单克隆抗体与电极上固定的抗体识别不同抗原决定位点，溶液中抗体浓度为100μg/mL，该溶液是将所述抗体溶于0.01M、pH7.4磷酸缓冲溶液而得，)各20μL混合后滴加在免疫传感器上，室温下静置反应0.4小时-0.6小时；这样，样品中分析物和碱性磷酸酶标记单抗分别通过免疫反应被捕获到传感器表面上，并形成一种单抗-分析物-酶标第二单抗的夹心复合物；

2.将所述传感器置于银沉积溶液中，该银沉积溶液为1mM抗坏血酸磷酸酯，2mM AgNO₃的0.1M甘氨酸-NaOH缓冲溶液，pH9.0；室温下静置反应8min-12min；然后从该传感器获取与分析物浓度相关的电导或电阻信号。

上述步骤(2)中，传感器表面上碱性磷酸酶催化其底物抗坏血酸磷酸酯水解产生还原剂抗坏血酸，后者将溶液中银离子还原成银金属并沉积在微间隙阵列金电极上，使微间隙阵列金电极正负电极部分导通，从而增大微间隙阵列金电极的电导(或降低电阻)，获得与分析物浓度相关的电导(或电阻)信号。

本发明的技术方案之三是，采用上述基于微间隙阵列电极的酶催化电导免疫传感器检测无碱性磷酸酶标记的单克隆抗体的分析物方法采用以下步骤：

1.将分析物样品或标样溶液(该溶液是将所述分析物样品或标样溶于0.01M、pH7.4磷酸缓冲溶液而得)、待测物鼠单克隆抗体溶液(抗体浓度为100μg/mL，该溶液是将所述单克隆抗体溶于0.01M、pH7.4磷酸缓冲溶液而得)各20μL混合后滴加在固定有待测物羊多克隆抗体的免疫传感器上，室温下静置反应0.5小时；这样样品中分析物和单抗分别通过免疫反应被捕获到传感器表面上，并形成一种多抗-分析物-单抗的夹心复合物；