[发明专利]阿尔茨海默病早期诊断液相芯片及其制备方法

权利要求书

1. 一种阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，主要包括有：

1)包被微球：含有分别包被了t-tau捕获抗体的微球，包被了p-tau231捕获抗体的微球，包被了p-tau181捕获抗体的微球，包被了p-tau199捕获抗体的微球，和包被了Aβ_1-42捕获抗体的微球，上述微球分别具有不同颜色编码；

2)生物素标记检测抗体：含有分别用生物素标记的t-tau、p-tau231、p-tau181、p-tau199及Aβ1-42的检测抗体；和

3)链亲和素藻红蛋白。

2. 根据权利要求1所述的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为110-140个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为1-3ug/ml。

3. 根据权利要求2所述的阿尔茨海默病早期诊断液相芯片，其特征是，每种包被捕获抗体的微球的使用浓度为120个/μl；每种生物素标记检测抗体的使用浓度为2ug/ml。

4. 一种制备权利要求1所述阿尔茨海默病早期诊断液相芯片的方法，主要包括以下步骤：

(1)每种相应的捕获抗体包被微球：

-将50μL微球活化后，≥15000rpm，离心；

-吸弃上清，将微球重悬于pH5.0的230-280μL 50mM的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min，后将微球于≥15000rpm，离心；重复该步骤；

-吸弃上清，将微球重悬于100μL 50mM pH5.0的MES的溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-往悬浮的微球中加入相应的0.8-1.2μg抗体，用50mM的pH5.0的MES溶液将总体积补至450-550μL；

-用涡漩振荡器混匀，室温避光振荡1.5-2.5hr；

-偶联了抗体后的微球以≥12000g的速度，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于500μL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；

-室温避光振荡30min；再于≥12000g，离心8-12min；

-吸弃上清，将微球重悬于1mL PBS-TBN溶液中，涡漩振荡约30s，超声处理1min；微球≥12000g，离心4-6min；重复该步骤一次；

-吸弃上清，将微球重悬于500-1000μL PBS-TBN溶液中；

-每种包被好的微球通过luminex仪器计数后置于2-8℃避光单独保存，使用时，依据检测需要等比例混合，使混合液中每种捕获抗体偶联微球的浓度均为110-140个/μl；

(2)每种检测抗体的生物素标记：

-依据检测抗体浓度计算出检测抗体溶液稀释至1mg/ml的体积，视为目标体积；

-用DMSO溶解，配置10mg/ml的NHS-Biotin反应液；

-按摩尔比1∶100于反应管中分别加入检测抗体与NHS-Biotin反应液；

-加入体积为目标体积的1/10的pH8.9的NaHCO₃溶液；

-加入pH7.4的PBS补至目标体积；

-包上铝箔，将反应管置于振荡器上，于25℃恒温箱中避光孵育3-5小时，转速为800rpm-1000rpm；

-将反应液转至透析盒内，于PBS缓冲液中透析过夜，以去除未反应的NHS-Biotin；

-使用时根据需要将标记好的每种检测抗体等比例混合，使每种检测抗体最终浓度达到1-3ug/ml。

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征是：所述活化微球的步骤如下：

-用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球；

-取50μL微球离心8-10min；

-去掉上清夜，将微球重悬于100μL的双蒸水中，用涡漩振荡器或者超声波悬浮微球约30s，超声处理1min，≥15000rpm离心8-12min；

-吸弃上清，加入80μL的磷酸盐缓冲液，涡漩振荡约20s，超声波悬浮微球约1min；

-加入10μL 50mg/mL Sulfo-NHS，用涡漩振荡器轻轻地混匀，超声处理1min；

-加入10μL 50mg/mL EDC，用涡漩振荡器轻轻地混匀；

-室温震荡反应约20min。