[发明专利]人对氧磷酶3基因表达载体的构建及其应用

说明书

一.技术领域

本发明属于生物技术制药技术领域。

二.背景技术

对氧磷酶3(PON3)是对氧磷酶基因家族发现最晚，研究最少的成员。人PON3基因cDNA全长1075bp，其中编码区长1065bp，编码354个氨基酸。基因表达产物PON3是分子量约40kDa的糖蛋白，是一种钙离子依赖性酯酶，具有芳香酯酶活性、内酯酶活性及抗氧化功能[Lu H Q，et al.Biochem Pharmaco，2005，70：1019-1025]。人PON3主要由肝细胞合成分泌入血，在血清中98％与HDL结合，但血清中PON3的含量仅为PON1的1/50。实验证明，PON3不仅有抑制HDL和LDL氧化修饰的作用，而且有更强的抗氧化能力，纯化的兔血清PON3在体外保护LDL抗铜离子诱导的氧化修饰的能力比PON1强100倍[Draganov DI，et al.JBiol Chem，2000，275：33435-33442]，因此目前大部分的研究集中在PON3降低体内的氧化压力，防治动脉粥样硬化方面。

已有的研究表明，氧化压力和脂质超氧化物的升高是多种肝脏疾病的共同病理机制，氧化压力升高导致活性自由基增加是肝损伤的重要致病因素，因此抗氧化治疗可应用于肝损伤防治。我们曾发现：肌肉电转移介导外源hPON1Q基因的表达与分泌，有效降低了肝脏的氧化压力，对四氯化碳诱导的小鼠急性肝损伤有很好的保护作用[秦浚川等，专利申请号：200610097968.6]。由于PON3表现出比PON1更强的抗氧化作用，且文献未见PON3应用于肝脏疾病预防的相关报道，我们研究了用转基因表达来提高血清PON3的活性以降低氧化压力，保护肝脏，这可能是一种新的防治肝损伤的途径。

四氯化碳单次注射诱导小鼠急性肝损伤是一种广泛使用的筛选和评价保肝护肝药物的模型，本发明同时建立了多次隔日注射四氯化碳诱导亚急性肝损伤模型用于评估电转移hPON3抗肝损伤的效果，此模型与急性肝损伤模型相比更接近于临床肝脏疾病的发生过程，因此更具有实际意义。

我国是肝脏疾病高发国家，病毒性肝炎、酒精及药物中毒性肝病等引起的肝损伤以及随之而来的慢性肝纤维化、肝功能衰竭等，已成为最常见疾病之一。传统的保肝药物包括抗氧化剂、内源性保护因子、抗胆汁淤积药物和部分植物药等。但是它们大多具有作用时间短、起效较慢、需长期多次用药等缺点，利用基因治疗的方法导入护肝基因药物并使之长期高效表达以预防和治疗肝脏疾病已成为一种有良好应用前景的策略。

作为基因转移的方法之一，电刺激可介导裸露质粒DNA在多种细胞和组织中的高效表达。与病毒载体相比，此技术具有生物安全性好、实验步骤简单、节约成本等诸多优点。骨骼肌组织细胞数量庞大，易于进行各种操作，组成细胞多为成熟的多核肌细胞且更新非常缓慢，供血丰富，蛋白合成能力强，细胞表达的蛋白质能正常分泌进入血液循环，这些特征决定了其可作为理想的基因转移的靶组织[McMahon JM，et al.Biodrugs，2004，18：155-165]。有报道证明，电刺激介导下外源基因在骨骼肌组织中的表达水平比传统非病毒载体转移方法提高2-4个数量级，基因最长可持续表达9个月以上。我们应用成都仪器厂生产的YC-2型程控刺激器，接上不锈钢针状电极，摸索了适当的电刺激参数，达到了较好的电转移效果。

三.发明内容

本发明需要解决的问题是构建重组人对氧磷酶3基因的哺乳动物细胞表达载体，利用电刺激介导的方法将其转入小鼠骨骼肌组织高效表达并通过自身N端信号肽持续分泌以提高血清PON3的活性，从而作为新型基因药物对抗由四氯化碳诱导的肝细胞损伤以有效地保护肝脏。

本发明的技术方案包括：1.重组人对氧磷酶基因3哺乳动物细胞表达载体pCI-hPON3的设计与构建。2.电刺激介导pCI-hPON3在小鼠骨骼肌中的高效表达与分泌。3.重组人PON3作为基因药物可提高血清hPON3水平，应用于防治肝损伤。

1.pCI-hPON3的设计与构建