[发明专利]一种发酵生产克拉维酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种发酵生产克拉维酸的新方法。

背景技术

由于青霉素的广泛使用，某些细菌对它产生了耐药性。青霉素类和头孢菌素类药物均含有一个共同的β-内酰胺结构，属β-内酰胺类抗生素。当使用具有这种结构的抗生素时，部分病原菌通过产生β-内酰胺酶而产生耐药性。克拉维酸(Clavulanic acid)，又称为棒酸，是由棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)产生的一种β-内酰胺酶抑制剂，它可以大大提高病原菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性。克拉维酸本身的抗菌活性很弱，但它是强力、广谱并且不可逆的β-内酰胺酶抑制剂。在体内或体外都能同耐药的革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌产生的β-内酰胺酶生成牢固不可逆的结合物，抑制耐药性细菌对β-内酰胺类抗生素的分解作用，从而恢复青霉素类和头孢菌素类抗生素对耐药菌的抗菌活性。

目前国内外实现了克拉维酸的工业化生产，多使用黄豆粉为主要氮源，使用甘油为主要碳源，发酵成本较高。

发明内容

本发明提供了一种新的发酵生产克拉维酸的培养基和发酵工艺控制方法。

本发明的方法包括斜面培养，摇瓶种子液培养，种子液培养和发酵培养四个步骤。具体工艺过程如下：

(1)斜面菌种的制备：将冻干的棒状链霉菌菌种(Streptomyces clavuligerus)用无菌水稀释后涂布装有固体培养基的斜面上，温度28℃，湿度40-60％，培养10-12天。产孢后加无菌水制成孢子悬浮液；

(2)摇瓶种子液制备：将斜面孢子接种摇瓶种子培养基，250rpm，温度28℃，湿度40-60％，培养20-40小时；

(3)种子液的制备：将(2)中培养好的摇瓶种子接种种子罐中，接种量为0.5-2％，在28℃下，搅拌转速300-500转/分，通气量0.5VVM-1.0VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05-0.07MPa的条件下，培养20-40小时；

(4)发酵培养：将(3)中培养好的菌种接到发酵罐中，接种量为5-15％(V/V)，在温度为28℃，搅拌转速为300-600转/分，通气量0.5VVM-1.2VVM(体积/体积/分钟)，罐压0.05-0.08MPa，pH为6.5-7.5，补入营养物质的条件下，培养90-120小时。

(1)步骤中所用培养基成分和含量为：葡萄糖4-10g/L，麦芽提取物4-10g/L，酵母膏4-10g/L，琼脂20-25g/L，pH为6.5-7.5。(2)步骤中所用培养基成分和含量为：蛋白胨3-10g/L，麦芽提取物3-10g/L，酵母膏3-10g/L，pH为6.5-7.5。(3)步骤中所用液体培养基成分和含量为：甘油10-20g/L，棉籽粉20-30g/L，麦芽提取物5-15g/L，消泡剂2-4g/L，pH为6.5-7.5。(4)步骤中所用液体培养基成分和百分比含量为：甘油 10-20g/L，棉籽粉40-60g/L，淀粉10-20g/L，KH₂PO₄ 1.0-3.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5-2.5g/L，FeSO₄·7H₂O0.005-0.035g/L，MnCl₂·4H₂O 0.005-0.015g/L，ZnSO₄·7H₂O 0.005-0.045g/L，消泡剂2-5g/L，pH为6.5-7.5。

在发酵过程中，在菌丝生长阶段(移种后至24小时左右)，补入麦芽提取物溶液的浓度为20-40％，补料速度为15-20ml/h。在发酵过程中，在产生克拉维酸阶段，补入麦芽提取物和甘油混合溶液的比例为0.5∶2-4∶10(麦芽提取物∶甘油∶水)，补料速度根据甘油在发酵液中的含量控制。

本发明的种子罐和发酵罐培养基中使用棉籽粉为主要氮源，而现有技术中使用黄豆粉为主要氮源，棉籽粉比黄豆粉价格低，使用棉籽粉可以降低原料成本。在发酵罐培养基中加入淀粉和甘油作为碳源，淀粉与甘油相比价格低廉，比其他方法中仅使用甘油为碳源降低了成本。发酵过程中不同时期使用不同的补料方式，提高了发酵效价，降低了发酵成本。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的技术方案并不限于如下实施例。

实施例1