[发明专利]一种多孔整体材料固定化酶微反应器的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质样品的酶解方法，具体地说是一种基于多孔整体材 料的固定化酶微反应器，实现蛋白质样品的高效、快速酶解。

背景技术

作为化学酶工程的一个重要分支，酶的固定化是指通过吸附、包埋、交 联、共价接合等方法使目标酶分子固定于特定的载体上而发挥酶的生物催化 作用。与溶液中的蛋白质酶解反应相比，固定化的酶具有更高的酶/底物比、 更高的酶解效率、可重复使用，并能减少酶的自身降解等优点。此外，使用 固定化酶反应器还可以避免样品的手工处理，从而也就减少了蛋白样品被污 染的可能性。

固定化酶的性能与载体材料和固定化方法密切相关。根据载体材料的 不同，固定化酶反应器可以分为颗粒填充型和整体材料型两大类。颗粒填充 型酶反应器的制备往往是先将表面带有某种官能团的颗粒进行活化而后固 定上酶分子，再将颗粒填充到柱管中。对于填充型酶反应器而言，液流主要 通过颗粒之间的空隙，从流动相向固定化酶的传质和从固定化酶向流动相的 传质主要由扩散系数决定，与填料孔径大小、流速和底物的扩散系数等有关。 蛋白质这类生物大分子的扩散系数较小，而填料颗粒之间往往有较大空隙， 使得填充型酶反应器的传质速率较低，活性不高。因此，填充型颗粒载体通 常并非理想的酶固定化载体材料。多孔整体材料是近年发展起来的一种新型 的色谱分离介质。通过优化合成条件，可以制备得到同时具有大的通孔和小 的扩散孔的多孔结构整体材料载体。对于基于多孔整体材料的固定化酶反应 器而言，传质速率得以显著提高，较快的传质使得蛋白分子更容易接近固定 化酶的活性位点，因此可以大大提高固定化酶反应的速度。

最近，Zare等采用光引发聚合法制备了一种硅胶整体材料共价键合型酶 反应器，可使25mM BAEE(L-苯丙氨酸-精氨酸-乙酯)在2分钟内酶解(Dulay， M.T.；Baca，Q.J.；Zare，R.N.Anal.Chem.2005，77，4604-4610)。Sakai-Kato等 采用溶胶-凝胶法制备了一种硅胶整体材料包埋型酶反应器，可使50mM BAEE在2秒钟内酶解(Sakai-Kato，K.；Kato，M.；Toyo’oka，T.Anal.Chem. 2002，74，2943-2949)，然而该酶反应器却不能对大分子蛋白质进行有效酶 解。

发明内容

本发明的目的在于提供一种多孔整体材料固定化酶反应器的制备方法， 而且所制备的酶反应器可实现蛋白质样品的高效、快速的酶解。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明采用四乙氧基硅烷(TEOS)和氨丙基三乙氧基硅烷(APTES) 为前体分子，以十六烷基三甲基溴化氨(CTAB)为模板分子，以无水乙醇 为共溶剂，经由溶胶-凝胶法和模板分子自组装法制备得到了一种多孔的有 机-无机杂化硅胶整体材料载体载体；对杂化硅胶整体材料用戊二醛活化， 固定上胰蛋白酶后即制备得到有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶反应 器。

具体为：

1)采用四乙氧基硅烷TEOS或四甲氧基硅烷TMOS与氨丙基三乙氧 基硅烷APTES一起作为前体分子，以带有C8-C16烷基链的阳离子表面活 性剂为模板分子，以无水乙醇或甲醇为共溶剂，加水后经由溶胶-凝胶法及 超分子模板法制备得到了一种有机-无机杂化硅胶整体材料载体；

步骤1)中TEOS或TMOS与APTES的物质的量之比为3/7--7/3；水 与前体分子(TEOS和APTES的物质的量的总和)物质的量之比为 ＝2.5/1-1.2/1，模板分子的质量mg与前体分子物质的量mmol之比为6-10；

无水乙醇或甲醇的体积μL与前体分子物质的量mmol之比为 175-250；溶胶-凝胶法聚合反应温度为25℃～80℃，聚合时间为12～24小 时；

所述模板分子最好为十六烷基三甲基溴化氨CTAB；其采用的前体分 子之一是氨丙基三乙氧基硅烷，其同时也是溶胶-凝胶反应的催化剂。

2)对杂化硅胶整体材料载体用戊二醛活化，最后连续泵过含有胰蛋白 酶、苄甲脒及的氰基硼氢化钠NaCNBH₃的磷酸盐缓冲溶液，即可制备得到 一种有机-无机杂化硅胶整体材料固定化酶微反应器。