[发明专利]增强蛋白表达和纯化的方法和组合物

说明书

Tauseef R.Butt

Tadas Panavas

Amolkumar Karwa

Raymond J.Peroutka

Jeffrey G.Marblestone

本申请根据35U.S.C.§119(e)，要求2006年12月29日提交的美 国临时专利申请No.60/877914的优先权。上述申请通过援引并入本 文。

发明领域

本发明涉及重组cDNA的表达和表达蛋白的纯化领域。更具体地 说，本发明提供了增强异源蛋白质从多种不同宿主物种中表达并利于 其纯化的材料和方法。

发明背景

贯穿本说明书引用了几种出版物和专利文献以描述本发明所属 技术领域状况。这些参考资料的全部引用可以在整个说明书中找到。 每个引用通过援引并入本文，如同全部阐述了一样。

在异种的表达系统中不能统一的表达和纯化具有生物学活性的蛋白已 经妨碍了功能基因组研究(Ryan和Patterson(2002)Trends Biotechnol， 20：S45-51)。尽管在特定表达载体中使用了相同的转录和翻译信号，仍观察 到表达蛋白水平的变化显著(Weickert等(1996)Curr.Opin.Biotechnol.， 7：494-9)。因此，人们已经开发了几种策略，使用在细菌、酵母以及哺 乳动物和昆虫的细胞中将异源蛋白质作为基因融合物表达(Ecker等 (1989)J.Biol.Chem.，264：7715-9；Butt等(1989)Proc.Natl.Acad. Sci.，86：2540-4；Kapust和Waugh(1999)Protein Sci.，8：1668-74；Ikonomou 等(2003)Appl.Microbiol.Biotechnol.，62：1-20)。

到目前为止，对于研究和商业目的来说，在细菌中表达异源基因 是最简单和最便宜的方法。然而，在大肠杆菌中某些异源基因产物不 能获得他们正确的三维构象，而其他异源基因产物过量生产时汇集 (sequestered)为大的不溶解的集合物或“包含体”(Jonasson等 (2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105；Georgiou和Valax(1999) Methods Enzymol.，309：48-58.)。为了获得合理的重组蛋白得率，经常 需要大量变性剂诱导的增溶方法之后再在适宜再折叠的条件下除去 变性剂。

对于结构基因组项目，开放阅读框(ORFs)的选择也表明只有大约 20％在大肠杆菌中表达的基因可以产生可溶的或正确折叠的蛋白质 (Waldo等(1999)Nat.Biotechnol.，17：691-5)。这些数字是非常令人失望 的，尤其是现在大多数的科学家依靠大肠杆菌来初始尝试表达基因产 物。几种通过连接标签如NUS A、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽 S转移酶(GST)和硫氧还蛋白(TRX)的蛋白表达系统已经开发出来 (Jonasson等(2002)Biotechnol.Appl.Biochem.，35：91-105)。所有的这些 系统都具有某些缺点，包括表达低效以及对期望结构切割不一致。