[发明专利]通过使用属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的细菌进行发酵来产生嘌呤核苷和核苷酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于产生嘌呤核苷的方法，嘌呤核苷在5′-嘌呤核苷酸如5′-肌苷酸或5′-鸟苷酸的合成中是重要原料；还涉及所述生产所使用的新的微生物。 

背景技术

按照常规，嘌呤核苷如肌苷、鸟苷和黄苷在工业上通过利用腺嘌呤营养缺陷型菌株进行发酵而产生。可选的是，可以进一步赋予这些菌株针对多种药物如嘌呤类似物和磺胺胍的药物抗性。这些菌株包括属于芽孢杆菌属(genusBacillus)的那些菌株(日本专利公告第38-23099号(1963)、第54-17033号(1979)、第55-2956号(1980)和第55-45199号(1980)，日本专利申请公开第56-162998号(1981)，日本专利公告第57-14160号(1982)和第57-41915号(1982)，及日本专利申请公开第59-42895号(1984))，或属于短杆菌属(genus Brevibacterium)(棒杆菌属(Corynebacterium))的那些菌株(日本专利公告第51-5075号(1976)和第58-17592号(1972)，和Agric.Biol.Chem.，42，399(1978))，或属于埃希氏菌属(genus Escherichia)的那些菌株(WO9903988)，等等。 

用于获得这样的突变菌株的典型方法包括，对微生物通过UV照射或通过用亚硝基胍(N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍)处理它们来进行诱变，和通过使用合适的培养基来选择突变菌株。另一方面，对于以下菌株也已经实践过使用遗传工程技术培育这样的突变菌株：属于芽孢杆菌属的菌株(日本专利申请公开第58-158197号(1983)、第58-175493号(1983)、第59-28470号(1984)、第60-156388号(1985)、第1-27477号(1989)、第1-174385号(1989)、第3-58787号(1991)、第3-164185号(1991)、第5-84067号(1993)和第5-192164号(1993))，属于短杆菌属(棒杆菌属)的菌株(日本专利申请公开第63-248394号(1988))，或属于埃希氏菌属的菌株(WO9903988)。 

能够通过增加嘌呤核苷分泌活性进一步改进产嘌呤核苷的菌株的生产力。普遍承认的是，代谢物通常由特定的流出转运蛋白(efflux transporter protein)介导而穿过细胞质膜(Pao等，Microbiol.Mol.Biol.Rev.，62，1-34，(1998)；Paulsen等，J.Mol.Biol.，277，573-592(1998)；Saier等，J.Mol.Microbiol.Biotechnol.，257-279(1999))。本发明人先前已经证明，RhtA蛋白(由rhtA(ybiF)基因编码)活性增强的属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的产肌苷或黄苷菌株与亲本菌株相比产生了更多的肌苷或黄苷(俄罗斯专利第2239656号)。除此之外，YijE、YdeD或YicM蛋白(分别由yijE、ydeD或yicM基因编码)活性增强的属于埃希氏菌属的产肌苷菌株与亲本菌株相比产生了更多的肌苷(分别为俄罗斯专利第2244003、2244004、2271391号)。 

本发明人先前已经发现大肠杆菌的yeaS(leuE)基因编码一种膜蛋白，该膜蛋白属于RhtB家族并且涉及氨基酸的流出(efflux)(Aleshin等，TIBS，1999)。具体而言，这种基因编码亮氨酸、组氨酸和甲硫氨酸的输出物(exporter)(Kutukova等，FEBS Letters，579，4629-4634，2005)。 

发明内容

本发明的目的是增强产嘌呤核苷的菌株的嘌呤核苷生产力，和提供使用这些菌株产生嘌呤核苷的方法。 

此目的通过鉴定yeaS基因达到。该基因编码推定的氨基酸输出物，当作为多拷贝载体上的野生型等位基因引入菌株时，该基因赋予对嘌呤碱基类似物，即8-氮杂腺嘌呤(8-azaadenine)、2，6-二氨基嘌呤、6-巯基嘌呤和6-硫代鸟嘌呤(6-thioguanine)的抗性。此外，当将在组成型启动子调控下的yeaS基因引入属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的各种产嘌呤核苷菌株的细胞时，yeaS基因能够增强嘌呤核苷生产。由此完成了本发明。 

因此，本发明提供属于埃希氏菌属或芽孢杆菌属的微生物，所述微生物具有产生嘌呤核苷的能力。