[发明专利]从生产细胞中分离蛋白质的方法

说明书

本发明涉及一种生物细胞的细胞消化并随后从生产细胞(production cell)中分离蛋白质的方法以及用于此的装置。

现有技术描述

如果通过发酵生产的产品为细胞内的，则在完全发酵以后，细胞一定 是破碎的(酶或蛋白质释放)。这涉及打开细胞和将内细胞组分释放，尤其 是关注的分子，通常为蛋白质至培养流体中。在这种情况下，这些蛋白质 已是所需天然形式还是以非活性形式作为内含体存在不重要。除关注的蛋 白质外，其他可溶蛋白质也在此过程中释放。在细胞破碎以后，产品然后 可例如通过在离心机中沉降、通过过滤或通过分级沉降以及如果合适的话 进一步提纯而从所谓细胞碎片中分离出。

用于细胞破碎的物理力为可通过冲击、摩擦、拉伸、施压、压制、气 蚀或发声而施加的机械力。在为此构造的机器和设备中，通常产生大量这 些主动力。表面上可见的特征为单位功率输入。在这种情况下，关于粉碎 作用引入的能量的可能最有效用途为选择方法的重要决策准则(Storhas W. Bioverfahrensentwicklung  [Bioengineering development].Wiley-VCh Verlag GmbH&Co KgaA Weinheim.2003)。除纯机械细胞破碎方法外， 也可使用化学(例如酸/碱性溶液、盐、溶剂)，生物如酶、噬菌体、自溶 (Wisemen，Process Biochem.463-65(1969)；Asenjo JA，Andrews BA， Hunter JB，LeCorre S，Process Biochem.20：158-164.1985，Lam KS， GrootWassink JWD，Enzyme Microb Technol.239-242.1985；Tanny GB， Mirelman D，Pistole T.Appl Environ Microbiol 40.269-273.1980)，热和 物理(例如渗透压、冻融、冷冻干燥)或这些细胞破碎方法的组合。例如Bailey 等(Improved homogenization of recombinant E.coli following pre-treatment with guanidine hydrochloride.Biotechnol Prog 11：533-539. 1995)报导通过在均化以前加入洗涤剂和离液剂而改善细胞破碎度。

高压均化为工业后处理实践中最常用的破碎设备。高压均化器的原理 基于使用强张力自发减压导致的气蚀，其导致细胞破碎。在气蚀气泡的破 裂中，产生达10⁵巴的压力，这也最终造成细胞的破裂。通常在低初始压 力下将悬浮液供入活塞泵，这将它加压至均化压力。在均化装置中，阀将 此压力转化成速度、剪切力、法向力和张力。形成高度气蚀流。取决于压 力，这些过程持续约200-250毫秒。高压均化器中影响破碎的主要因素理 论上为均化压力差、传代数(number of passages)、均化阀设计、进料浓度 和温度(Storhas，2003)。

在高压细胞破碎期间，温度上升通常与所用压力差成比例地提高(约 2.2℃每10Mpa，Storhas，2003)。由于在更高压力差下改善的细胞破碎而 产品收率提高可通过产品的热钝化被抵制。增加压力差以改善细胞破碎度 的结果是增加的冷却能力。

通过优化阀构造，节能可随恒定的产品质量和/或改善的下游性能实 现，这是由于对于相同能量输入，例如细胞碎片更小或细胞碎片粒度分布 更窄。例如Storhas(2003)论证了刀口阀在关于从面包酵母中释放酶的实验 中具有最高效率，然后是锥形阀和平座阀。

市售的高压细胞破碎的变式为“Microfluidizer”(来自Microfluidics， USA)。在这种情况下，细胞悬浮液通过使用增压泵以恒定流率达到所需压 力。然后，细胞悬浮液通过被称为破碎室的具有固定几何形状的极精微通 道，因此细胞悬浮液加速至高速。在此产生非常高的剪切速率(＝剪切区)。 在剪切区之后，细胞悬浮液通入冲击区，其中细胞通过冲击破碎。就此破 碎方法而言，对于大肠杆菌(E.coli)悬浮液在1240巴下单代，可预期破碎 度为至多99％(Microfluidics brochure，Innovation by Microfluidizer processor technology，2005)。