[发明专利]使用真核细胞系生成蛋白质

权利要求书

1.一种位点特异性整合靶载体，所述载体包括：

(a)第一载体重组位点，其在第一单向位点特异性重组酶存在下与基因 组重组位点重组；

(b)第二载体重组位点，其在不同于所述第一单向位点特异性重组酶的 第二单向位点特异性重组酶存在下与供体重组位点重组；

(c)与所述第二载体重组位点的3’端相邻的第一选择性标记的第一部 分；和

(d)不同于所述第一选择性标记的第二选择性标记。

2.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述基因组重组位点是哺乳动 物基因组重组位点。

3.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一载体重组位点是细菌 基因组重组位点(attB)或噬菌体基因组重组位点(attP)。

4.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一载体重组位点是细菌 基因组重组位点(attB)，并且所述基因组重组位点是拟噬菌体基因组重组位 点(拟attP)。

5.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一载体重组位点是噬菌 体基因组重组位点(attP)，并且所述基因组重组位点是拟细菌基因组重组位 点(拟attB)。

6.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一载体重组位点是拟细 菌基因组重组位点(拟attB)或拟噬菌体基因组重组attP位点(拟attP)。

7.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第二载体重组位点是细菌 基因组重组位点(attB)或噬菌体基因组重组位点(attP)。

8.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第二载体重组位点是拟细 菌基因组重组位点(拟attB)或拟噬菌体基因组重组attP位点(拟attP)。

9.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一单向位点特异性重组 酶是噬菌体重组酶、TP901-1噬菌体重组酶、R4噬菌体重组酶、噬菌体重组酶、噬菌体重组酶或噬菌体重组酶。

10.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第一单向位点特异性重组 酶是噬菌体重组酶。

11.根据权利要求1所述的靶载体，其中所述第二单向位点特异性重组 酶是R4噬菌体重组酶。

12.一种将编码感兴趣蛋白质的多核苷酸位点特异性地整合入真核细 胞基因组的方法，所述方法包括：

(a)将权利要求1所述的靶载体导入包含第一单向位点特异性重组酶的 哺乳动物细胞并使所述哺乳动物细胞保持在足以发生由所述第一单向位点 特异性重组酶介导的、在所述第一载体重组位点和所述基因组重组位点之 间重组事件的条件下，以将所述靶载体位点特异性地整合入所述哺乳动物 细胞的基因组中；

(b)将供体载体导入包含第二单向位点特异性重组酶的靶细胞，其中所 述供体载体包含所述编码感兴趣蛋白质的多核苷酸和供体重组位点，并使 所述靶细胞保持在足以发生由所述第二单向位点特异性重组酶介导的、所 述供体重组位点和所述靶载体的第二载体重组位点之间重组事件的条件 下，以将所述编码感兴趣蛋白质的多核苷酸位点特异性地整合入所述哺乳 动物细胞的基因组中；

其中所述第一单向位点特异性重组酶不同于所述第二单向位点特异性 重组酶。

13.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括选择表达所述感兴趣 蛋白质的细胞。

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一载体重组位点是细菌 基因组重组位点(attB)或噬菌体基因组重组位点(attP)。

15.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一载体重组位点是细菌 基因组重组位点(attB)，并且所述基因组重组位点是拟噬菌体基因组重组位 点(拟attP)。

16.根据权利要求12所述的方法，其中所述第一载体重组位点是噬菌 体基因组重组位点(attP)，并且所述基因组重组位点是拟细菌基因组重组位 点(拟attB)。