[发明专利]通过聚乙二醇沉淀预测多肽的相对溶解度

说明书

发明领域

本发明基本涉及蛋白质表征领域。更具体地，本发明涉及预测蛋白质 溶解度的方法。

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请系列号60/801,862的优先权，该临时申请于 2006年5月19号递交，其全部内容在此通过引用并入本文中。

发明背景

配制包含多肽的药用组合物的一个重要方面是测定待在制剂中使用的 多肽的溶解度。由于，例如，操作步骤多和难以得到足够量的待测多肽， 对于评估大量不同多肽的溶解度，通常不易使用测定溶解度的方法。

聚乙二醇(PEG)为无毒、非吸收性的长链两性合成聚合物，广泛用 于许多工业用途。由于可在室温用于多肽沉淀，PEG在实验室或工业应用 中是非常有用的分子。

在探索或研发的早期，对于作为例如药物候选物的多肽，需要有高通 量筛选法测定其溶解度，从而在研发的相对早期，例如，在商业规模生产 之前鉴别溶解度可能存在问题的多肽。另外，例如在只能得到极其有限量 多肽的时候，最小化测试溶解度所需要的原料量十分有利。

发明概述

本发明涉及预测一种或多种多肽的相对溶解度的方法，包括用PEG 体积排阻沉淀多肽。此处称该测定法为“相对溶解度测定法”或“PEG沉 淀测定法”。更特别地，由本方法测定的实验多肽可与一种或多种已知溶解 度的多肽相比较，从而在以耗时、昂贵的商业规模生产实验多肽之前，鉴 别具有潜在的溶解度难题的多肽。对于选定的多肽，本方法还可用于鉴定 其适于多种用途的参数。

因此，本发明涉及预测实验多肽相对溶解度的方法。本方法包括：提 供实验多肽溶液的一个或多个样品，由此提供实验样品；将实验样品与不 同浓度的聚乙二醇(PEG)接触，从而形成沉淀的样品；测定与PEG接 触过的各实验样品的沉淀；将沉淀的样品中实验多肽的沉淀量，与在相应 条件下分析的、至少一种参照多肽样品的溶解度相关联，从而确定实验多 肽相对于参照多肽样品的溶解度；或将不同实验条件下沉淀的样品中实验 多肽的沉淀量关联起来，从而确定各实验条件下实验多肽的相对溶解度。 在一些实施方案中，实验多肽为抗体或抗体的片断、可与配体结合的分子、 或可溶的受体。在某些实施方案中，本方法还包括，用各样品测定的溶解 度值的对数对该样品的PEG浓度作图，将得到的线条外推至PEG百分比 为零，从而提供多肽的表观溶解度值。在一些情况下，实验多肽不与PEG 结合。在某些实施方案中，实验多肽的PEG沉淀为可逆的。在一些情况 下，PEG沉淀可能不改变实验多肽的二级结构。对一些实施方案，待分析 实验多肽的起始浓度不会大幅影响得到的溶解度值。本方法包括这样的实 施方案，其中温度升高提高选定的PEG浓度下的溶解度值，或在缓冲液 中加入蔗糖提高实验多肽的溶解度。本方法的实施还可以使得，用较高分 子量的多肽样品的溶解度对数值对PEG浓度作图，得到的曲线的斜率相 对于较低分子量的多肽的曲线斜率有所增加。在本发明的一些实施方案中， 参照为溶解度已知的多肽。在一些情况下，用溶解度已知的多个多肽作为 参照，例如，来建立标准曲线，通过它可确定实验多肽的相对溶解度。在 某些情况下，参照多肽选择为实验多肽的相似类型，例如，当实验多肽是 抗体，测定其相对溶解度时，可用已知溶解度的抗体作为参照多肽。在一 些实施方案中，通过测定沉淀的样品的浊度检测沉淀。在一些实施方案中， 离心沉淀的样品并测定沉淀量，测定上清中的蛋白质的量，或测定沉淀中 的蛋白质的量。

另一方面，本发明涉及测定多肽相对于分子量几乎相同的、至少一种 其他多肽的相对溶解度的方法。本方法包括：提供相同浓度的、至少两种 不同多肽的样品；将各多肽样品与一定浓度范围内的实验PEG相接触； 测定沉淀多肽样品的最低实验PEG浓度，从而确定沉淀各多肽的PEG最 小百分比；将PEG的最小百分比与各多肽相对于其它各多肽的溶解度相 关联。在本方法的一些实施方案中，以96孔板形式进行测定法的一个或多 个操作。在本方法的一些实施方案中，PEG的浓度范围约2％-16％。可通 过确定导致样品乳光的最小实验PEG浓度，视觉上读取孔板或其它多样 品形式。在一些情况下，用自动读板器读取板中样品的乳光。