[发明专利]保持、改善和恢复软骨细胞的软骨表型的方法

说明书

技术领域

本发明涉及软骨细胞扩充和软骨修复领域。本发明还涉及软骨的可 控性细胞群可用于保持、改善或恢复诸如软骨细胞或软骨母细胞的成软 骨细胞的软骨表型。

发明背景

关节软骨和半月软骨均在正常关节运动机制中起重要作用。关节软 骨覆盖膝关节诸骨的末端。它由稀疏分布的包围在细胞外基质中的细胞 (软骨细胞)组成，软骨基质由胶原、多种蛋白质/糖蛋白和携带称为粘多 糖的负电荷多聚糖的高保水性的蛋白聚糖组成。半月软骨是以细胞出现 在基质中成行和成束的胶原纤维中排列的陷窝中为特征的纤维软骨。关 节软骨和/或半月软骨的损伤是影像数百万人的常见病患。该损伤由于 成人关节软骨的弱的再生性和损伤带来的运动障碍和疼痛而变得复杂。 近年来已提出几种软骨修复的模式。其中一种模式，“自体软骨细胞迁 移”技术(ACT)，从健康逛街软骨收集细胞，进行培养扩增以得到足够 的细胞数，并再植入关节或半月软骨缺损[Brittberg等(1994)N Engl.J Med.331，889-895]。细胞扩充必须从小的活检软骨获取以修复软骨缺 损。ACT技术有例如软骨细胞在单细胞层培养中扩增具有与增加的传 代数量去分化倾向的限制。这种去分化将导致基质的合成物与原始组织 中的合成物具有不同的生物化学和生物机械特性。需要优化细胞培养条 件和限制传代数量以保持软骨细胞的表型性质，包括在体内形成稳定的 玻璃样软骨的能力，抵抗血管侵蚀和软骨内成骨。所有目前采用的ACT 技术使用由取自原始活检通过细胞培养方法的扩充的软骨细胞群组成 的细胞疗法。不可否认，这些细胞群包含不同数量的保持其表型稳定性 的和不能稳定地朝形成关节软骨细胞分化的去分化细胞。这种情况在组 织修复质量的临床研究中表现为从纤维软骨上玻璃样软骨到未显示修 复的高度变异性中得到验证[Peterson等(2000)Clin Orthop Res.374， 212-234]。这提示软骨细胞扩增的数量不足以达到实现成功移植的程 度。

已采用多种努力以改进软骨细胞的质量或使用软骨细胞的替代来 源。(WO0124833)描述了使用分子标记物作为软骨细胞扩增或传代的质 量控制。这些标记物的使用能够确定一个软骨细胞群的传代数量是否能 在移植后不明显损失软骨形成能力。已使用不同方法通过对软骨细胞增 加不同基质组分(例如基底膜蛋白聚糖)以增加ACT的结果[French等 (1999)J.Cell.Biol.145，1103-1115]。

也有报道环境基质对软骨细胞再生能力的影像。Graff等[2003， Biotechnol.Bioeing.82，457-464]描述了取自软骨的以存在原生细胞外 基质(“软骨质”)为特征的一种细胞群，并记载了这些细胞相对于已在体 外重建其细胞外膜的软骨细胞具有增强的软骨形成特性。

已描述软骨活检包括：除了典型的软骨细胞，还有具有不同形态和 行为的小部分细胞。Kamil等[2004，Tissue Eng.10，139-144]描述了在扩 增方案中为了获得更高的产量从软骨活检去除通常称为“泡沫细胞”的 细胞群，并描述了这些细胞如何能够仍然被扩增。该报道建议除了经典 的粘附软骨细胞部分软骨活检的其它部分也可用作成软骨细胞的来源。

尽管有多种方法扩增软骨细胞并验证其质量，仍不能在限定的传代 数量中获得足够数量的表型稳定的软骨细胞，以改进低质量软骨细胞的 特性或恢复不当处理后(例如，过度孵化或扩增)细胞特性的恢复。对于 在ACT中对产生稳定数量高质量细胞的方法的需求，需要能够保证在 活检中软骨细胞质量和数量的一致性、独立性的方法。

发明概述

本发明涉及可获自软骨的细胞群，当与有成软骨能力的细胞群组合 时其具有调节效应，从而增加、诱导或恢复软骨细胞表型稳定性。该调 节细胞群自然状态下表现为新鲜分离的软骨活检的一部分，但可基于其 物理和/或生理属性富集和/或分离。已证实该细胞群冷冻时保持其调节 能力，使存储调节细胞群(以富集形式或非富集形式)成为可能，例如在 此期间须将成熟软骨细胞扩增至移植所需的足够大的数量。一旦获得足 够数量的软骨细胞，该软骨细胞群与调节细胞群组合，组合后的细胞群 准备供移植。

并且已发现该调节细胞群可在一定时间内通过采集从软骨活检的 软骨细胞分离，如在接种后约2到5天和/或当粘附细胞达到培养容器 的细胞非粘附部分的至少30％汇合时。