[发明专利]一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法

说明书

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆/血清中重组双功能水蛭素的方法。

背景技术

水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶结合，以防止血栓形成。由于其抗栓抗凝作用优于传统抗凝药肝素，因此具有广阔的应用前景。目前已通过基因工程技术获得重组水蛭素。

重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin)是一种新型高效的抗凝血药物，目前处于临床I期研究阶段，为了开展该药物的体内药动学研究，体内药物的浓度测定是关键的技术之一。

目前国内外有关测定水蛭素的方法主要采用凝血酶时间测定法(TT法)、APTT测定法、生物底色法、蝰蛇毒凝血时间测定法(ECT法)、放射免疫法、酶联免疫法(EMIT)以及荧光标记测定法等。上述这些方法存在种种缺陷：如操作繁琐费时，效率低，选择性差，灵敏度低等。由于水蛭素是水溶性物质，将其从血浆中分离存在很大的困难，迄今未见有效的方法将其分离并浓缩，也使血浆中低浓度的有关水蛭素药物的定量分析无法实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、灵敏测定人血浆中水蛭素浓度的方法，具体涉及一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法。

本方法对血浆或血清样品进行定量分取，用超滤法分离出超滤液，超滤液经冷冻干燥，复溶解后进色谱柱分离，经色谱柱分离后，用质谱检测器检测，进行血浆/血清中水蛭素浓度的测定。

本方法具有准确、灵敏，选择性好，血浆用量少等优点，适合该水蛭素药物的体内浓度测定和体内过程的研究。

本发明方法通过下述方法和步骤进行：

对待测样品经过预处理后，利用超滤技术将蛋白从药物中分离出来，采用乙腈∶0.1甲酸为流动相，梯度洗脱，质谱检测；包括以下步骤：

(1)蛋白分离

水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离：以20％甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀后置于超滤管(Millipore，50K)于4000g，25℃条件下超滤20min；

(2)样品富集

水蛭素的浓缩：超滤液置于1.5ml Eppendorf管中，-70℃条件下冷冻干燥，完全冻干后取出；-70℃条件下保存；

(3)样品分析

将冻干后的样品取出，加入10％甲酸50μl复溶解，10μl进样做LC/MS分析；

色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用甲醇和0.1％甲酸溶液，梯度洗脱；

质谱条件：单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下选择离子监测(M/Z 1433)，干燥气流速：13L/min，雾化气压力：50psig，干燥气温度：350℃，碎片电压：220V，毛细管电压：5500V，内标法定量。

所述的待测样品为人血浆和/或血清；

所述的色谱条件其中色谱柱采用Agilent Extend C₁₈分析柱(150×2.1mm，i.d.，5μm)；柱温为35℃；流动相是甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.3ml/min；质谱条件采用电喷雾离子化，采集正离子。

本方法可用于血浆/血清中水蛭素定量测定。

本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的选择性和灵敏度均得到明显的提高，使重组双功能水蛭素的灵敏度提高两个数量级，可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定，适合于重组双功能水蛭素体内药物的浓度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。

本发明方法具有如下优点：采用超滤法分离蛋白，解决了水溶性的水蛭素和蛋白的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器，大大提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间为15min以内。重组双功能水蛭素的最低检出量为25ng/ml血浆。线性范围为25～250μg·L^-1，线性相关系数良好，方法回收率大于50％，RSD小于10％。

附图说明

图1是典型色谱图，其中，

上图为空白血浆；中图为空白血浆+标准品；下图为血浆供试品；

1为重组双功能水蛭素，2为硫酸奎宁(I.S.)。

具体实施方式

实施例1

高效液相色谱质谱联用条件