[发明专利]离子交换色谱固定相及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及离子交换色谱固定相及其制备方法和应用。

背景技术

离子交换是高效液相色谱(HPLC)中必不可少的分离模式，它广泛地应用于生物医学领域，如氨基酸分析，肽和蛋白质的分离。使用离子交换色谱分离蛋白质时，被分离的蛋白质的电荷密度和等电点值与色谱柱上的离子交换剂的离子容量大小决定保留能力的强弱。

离子交换色谱固定相按其基质的成分大致分成有机和无机基质两大类。有机基质填料具有良好的化学稳定性，可以在广泛的pH值范围内使用，能耐碱洗，具有较好的再生能力。但是它们机械强度不高，孔结构比较复杂，在洗脱过程中容易产生溶胀或者收缩现象，这些因素限制了有机基质填料在离子交换色谱中进一步的应用。目前，包括硅胶、二氧化锆在内的无机基质填料是研究和应用的主流。硅胶具有良好的机械强度、容易控制的孔结构和比表面积，可是它在碱性介质(pH＞8)中不稳定，而且表面的硅羟基去质子化后易与蛋白质的氨基发生较强的相互作用，因而不适于蛋白质分离。二氧化锆化学稳定性好，表面存在着丰富的路易斯酸位点，用路易斯碱对其改性后能实现碱性蛋白质的分离。其缺点就是比表面积小，孔径难以控制。

羟基磷灰石也是一种可用于液相色谱填料的基质材料，主要成分为羟基磷酸钙，Ca10(PO4)6(OH)2。羟基磷灰石属于六方晶体，晶体上有两种不同的晶面，形成了两种具有不同吸附特性的吸附位点，即位于Ca2+离子上的吸附阴离子的位点和位于PO43-离子上的吸附阳离子的位点，因此具有弱阴离子和弱阳离子交换的特性。另外，羟基磷灰石是动物骨骼的基本成分，具有很好的生物相容性，所以它可以用作蛋白质分离的离子交换色谱填料。这一应用始于1956年Tiselius等人的报道。1983年，出现了商品化的羟基磷灰石填充的HPLC色谱柱。这种羟基磷灰石由细小的片状晶体组成，形状大小差别大，且在流动相的压力下容易破碎，因而，柱效、柱子的通透性以及稳定性都不是很好，限制了它的广泛使用。

近二十年来，为了提高羟基磷灰石的机械强度，改善分离性能，扩展使用范围，人们提出了各种途径弥补羟基磷灰石晶体易碎的缺点。一方面是制备球形羟基磷灰石，如二次造粒技术、喷雾热解法等。但是这些球形颗粒是羟基磷灰石微晶通过物理作用堆积而成，机械强度的改善收到限制。中国科学院华工冶金研究所提出的均相法制备的球形羟基磷灰石，具有粒径可控、性能稳定的特点，适合填充出柱压低、流速快的HPLC色谱柱。另一方面是制备羟基磷灰石的复合物。有研究将磷酸化的硅胶微球先后浸入氯化钙和磷酸溶液得到羟基磷灰石的替代物用来分离小麦胚芽中的拓扑异构酶。Honda等人用干法制备了羟基磷灰石或者牛骨灰包覆聚乙烯的复合物，在梯度洗脱的模式下成功分离了五种蛋白质。然而，由于疏水作用，蛋白质与聚乙烯之间会发生不可逆吸附，从而导致蛋白质回收率不高。

发明内容

本发明提供一种制备简单、成本低廉的羟基磷灰石包覆的离子交换色谱固定相及其制备方法和用途。

本发明提供的技术方案是：一种离子交换色谱固定相，由表面包覆有羟基磷灰石的色谱基质材料构成。

上述色谱基质材料为硅胶或锆镁复合氧化物。

本发明还提供了上述离子交换色谱固定相的制备方法：将硅胶微球或锆镁复合氧化物微球于36.5±0.5℃，浸泡于过饱和钙磷溶液中20-30天，得到表面包覆有羟基磷灰石的色谱基质材料即为离子交换色谱固定相。

上述硅胶微球先经过酸的活化，再浸泡于过饱和钙磷溶液中。

上述锆镁复合氧化物先经过预钙化处理，再浸泡于过饱和钙磷溶液中。

上述过饱和钙磷溶液可通过下法制备：将氯化钠，氯化钾，磷酸氢二钠，盐酸，氯化钙依次溶于二次水中，其最终离子浓度分别为[Na⁺]＝136.8mM、[K⁺]＝3.71mM、[Cl^-]＝144.5mM、[Ca²⁺]＝3.10mM、[HPO₄^2-]＝1.86mM；最后用三羟甲基氨基甲烷调节pH值为7.4。

上述离子交换色谱固定相可用于蛋白质的分离，不会与蛋白质等生物大分子发生非特异性吸附，能获得很高的回收率。