[发明专利]粘性沙雷氏菌及其生物转化DL－乳酸生产丙酮酸

说明书

(一)技术领域

本发明涉及生物转化DL-乳酸生产丙酮酸，特别是以粘性沙雷氏菌生物转化DL-乳酸生产丙酮酸。

(二)技术背景

丙酮酸，是重要的α-氧代羧酸之一，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气，易吸潮、聚合、分解，能与水、乙醇、乙醚等混溶。

丙酮酸(盐)及其衍生物广泛应用于制药、日化、食品和农用化学品等行业。丙酮酸是酶法合成多种氨基酸和维生素的前体物质：制药工业上可用于酶法合成L-色氨酸、合成L-半胱氨酸、L-多巴、L-亮氨酸，合成系列酶蛋白抑制剂、镇静剂、2-苯基喹啉-4-羧酸、磷酸烯醇丙酮酸、4-甲唑甲酸等，特别是丙酮酸钙作为一种减肥药品被开发后，目前丙酮酸的市场需求量很大；食品工业上可用作防腐保鲜剂；日化工业上，丙酮酸乙酯可抑制表皮中酪氨酸酶的形成美白皮肤，可用作化妆品的防腐剂和抗氧剂，用作空气清新剂；农用化学方面，丙酮酸乙酯是合成乙烯聚合物、氢化阿托酸、谷物保护剂、成熟剂等多种农药的起始原料；生化试剂和生物传感器方面丙酮酸也有较广泛的应用。因此，微生物转化乳酸生产丙酮酸的研究有着重要意义。

国内外用微生物法转化乳酸生产丙酮酸已有一些文献报道，用于生产丙酮酸的微生物主要是迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)(J.Ferment.Bioeng.81(1996)357-359)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)(J.Biotechnol.31(1993)191-203)、奇异变形杆菌(Proteus mirabils)(J.Biotechnol.31(1993)191-203)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)(Chin.J.Appl.Envi ron.Biol.7(2001)617-620)、不动杆菌属(Acinetobacter)(Biotechnol.Prog.19(2003)1672-1676)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)(Biochem.Eng.J.22(2005)89-96)和斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)(Biotechnol.Lett.29(2007)105-110)。

微生物转化乳酸生产丙酮酸具有转化率高、产物易分离、环境污染小等优点，符合绿色化学的发展方向；DL-乳酸和丙酮酸也有较大的差价，因此，微生物转化DL-乳酸生产丙酮酸的研究有着重要的社会效益和经济效益。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供能转化乳酸生产丙酮酸的粘性沙雷氏菌(Serratiamarcescens)ZJB-07166及其在制备丙酮酸中的应用。

本发明提供的粘性沙雷氏菌(Serratia marcescens)ZJB-07166保藏于中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏地址：中国武汉武汉大学生命科学学院，保藏编号CCTCC No：M207140，保藏日期为2007年9月7日。

本发明所述粘性沙雷氏菌ZJB-07166由以下途径筛选得到：

(1)富集培养基及条件：DL-乳酸钠10g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化铵3g/L，用蒸馏水配制，pH7.0。培养条件：30℃，摇床转速150r/min。5g土样加入100mL富集培养基培养，培养48小时后，转接1mL富集培养液至新的富集培养基培养。

(2)第二次富集培养液稀释后涂布到平板培养基上，30℃培养箱恒温培养24小时，挑取单菌落至斜面培养后保藏，斜面培养条件为30℃培养箱恒温培养24小时。平板培养基及斜面培养基组分：DL-乳酸钠10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨5g/L，琼脂15g/L-20g/L，pH7.0。

(3)挑取的单菌落接种到菌体培养基，培养36小时，离心收集菌体，用pH7.0，0.05M磷酸钠缓冲液洗涤两次后，离心收集菌体，所得菌体与底物DL-乳酸均匀分散于蒸馏水中，底物浓度50mM，30℃，150r/min水浴下反应12小时。转化液通过液相检测，能转化DL-乳酸生成丙酮酸的菌株为目的菌株。所述菌体培养基组分：DL-乳酸钠10g/L，磷酸二氢钾1g/L，磷酸氢二钾1g/L，氯化铵3g/L，用蒸馏水配制，pH7.0。

本发明中丙酮酸采用液相色谱的方法进行检测，检测条件为：C18反相色谱柱，流动相为0.005M硫酸溶液，流速为1mL/min，检测波长215nm，进样量20μL，柱温：30℃。