[发明专利]人胰岛素类似物的制备方法及用途

权利要求书

1.一种人胰岛素类似物，其特征在于具有这样的形式：(I式)

其中：

R₁为Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一个氨基酸残基；

R₂为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基；

R₃为n段-R2-R1-二肽片断，n取0、1、2、3、4之中的任意一个数字。

2.根据权利要求1所述的人胰岛素类似物，其特征在于R₁和R₃中的R₁为Pro，R₂为lys，R₃中的R₂为Arg，n为1。

3.根据权利要求1或2中所述的人胰岛素类似物的制备方法，其步骤包括：

(1)构建一种可复制的表达载体，该载体包含一段编码具有氨基酸序列II的人胰岛素类似物的DNA序列：

Met-X²_b-Y-R₃-R₂-R₁-Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-

Leu-Tyr-leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-X¹_a-Arg-Gly-

Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn

                                     II

其中

X²_b为含有b个氨基酸残基的肽链，b为非负整数；X¹_a为含有a个氨基酸残基的肽链，a为非负整数；

Y为Arg或Lys；R₁为Pro，Ala，Gly，Ser，Val，Leu中的任意一个氨基酸残基；

R₂为任意所需要的遗传上可编码的氨基酸残基；R₃为n段-R2-R1-二肽片断，n取0、1、2、3、4之中的任意一个数字；

(2)人胰岛素类似物前体的表达，其中宿主细胞采用优选的宿主菌，检测方法用SDS-PAGE电泳法；

(3)分离得到人胰岛素类似物前体；

(4)用酶学方法从人胰岛素类似物前体释放人胰岛素类似物；

(5)得到人胰岛素类似物，其中步骤为纯化-除盐-冻干-分离。

4.根据权利要求3所述的人胰岛素类似物的制备方法，其特征在于步骤(1)中引物P1和P2的核苷酸序列为

P1：5’ACAGGATCCAAGCGTCCGAAACCGTTTGTCAATCAGCACCTT 3’

P2：5’TTAAAGCTTAGTTGCAGTAGTTCTCC 3’

载体质粒选用PET28a质粒。

5.根据权利要求3所述的人胰岛素类似物的制备方法，其特征在于步骤(2)中人胰岛素类似物的前体从氨基端到羧基端分别含有融合肽段、胰岛素B链、连接肽和胰岛素A链。

6.根据权利要求3所述的人胰岛素类似物的制备方法，其特征在于优选的宿主菌是大肠杆菌。

7.根据权利要求3所述的人胰岛素类似物的制备方法，其特征在于步骤(4)中酶学方法是利用胰蛋白酶和羧肽酶B释放人胰岛素类似物。

8.根据权利要求3所述的人胰岛素类似物的制备方法，其特征在于步骤(5)中纯化步骤采用的层析方法为阴离子交换层析法，经SDS-PAGE电泳检测达到电泳纯。

9.根据权利要求1或2中所述的人胰岛素类似物在用于治疗糖尿病药物中的用途。