[发明专利]识别磷酸化多肽的抗体

说明书

发明领域

本发明涉及一种抗体，其结合由Ser-Ile-A1-A2-A3-A4-Ser(PO₃H₂)- Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-A5组成的表位，而不结合由Ser-Ile-A1-A2- A3-A4-Ser-Pro-Gln-Leu-Ala-Thr-Leu-Ala-A5组成的表位，其中A1是Asp 或Asn，A2是Met或Leu，A3是Val或Leu，A4是Asp或Glu，而A5 是Asp或Glu。

发明背景

阿尔茨海默氏病(AD)是最常见的成年发作型痴呆。当前没有可用于 AD诊断的可靠的生物化学试验或生物标记物，仅能在死后做出确凿诊断。

死后脑的神经病理检查显示在脑特征性区域中有大量的细胞外淀粉样 蛋白斑和细胞内神经纤维缠结(NFT)。NFT沉积较斑块累积与疾病的严 重性更为相关。

NFT包括由微管相关蛋白tau组成的成对螺旋丝(PHF)(Delacourte，A， J.，Neurol.Sci.76(1986)173-180；Kosik，K.，PNAS 83(1986)4044-4048； Kondo，J.，Neuron 1(1988)82；Wood，J.，PNAS 83(1986)4040-4043)。tau 的体内功能是在神经元的轴突区室内促进微管装配和稳定性(Lewis，S.， Nature 342(1989)498-505)。

Tau是高度可溶性蛋白质，无论什么情况下都不倾向聚集成丝。然而， 在AD中，tau变得过度磷酸化(hyperphosphorylated)。这种过度磷酸化引 发聚集过程，结果形成PHF，并最终形成NFT。磷酸化是tau的正常特征， 并且是调节与微管结合的控制机理的一部分(Lovestone，S.，Biol. Psychiatry 45(1999)995-1003)。

Tau分子内有大量潜在的磷酸化位点，这些位点位于其微管结合结构 域侧翼的两个区域内。这些位点上的磷酸化是良性的，并不导致tau聚集。 在AD中，发现了离散的多个其他磷酸化表位(包含至少一个磷酸化氨基 酸的表位)，正是过度磷酸化或异常磷酸化最有可能起始纤维化过程。从而 对导致PHF-tau形成机理的理解需要这些磷酸化位点的知识。

通过从AD脑中分离和表征PHF，已经鉴定了发生在AD中的tau异 常磷酸化表位(Hasegawa，M.，J.Biol.Chem.267(1992)17047-17054； Cripps，D.，J.Biol.Chem.281(2006)10825-10838)。这些磷酸化表位之一发 生在接近tau蛋白C末端的Ser422。Ser422的磷酸化与NFT形成紧密联 系(Jicha，G.，J.Neurochem 69(1997)2087-2095)。该研究小组在细胞培养实 验中显示tau在Ser422处的磷酸化导致tau溶解性降低，暗示着其在聚集 过程起始步骤中的作用。Ser422突变成丙氨酸消除了这种效应(Ferrari，A.， J.Biol.Chem.278(2003)40162-40168)。

tau在Ser422处的磷酸化可能是AD的灵敏标记物，这在使用抗此磷 酸化表位的多克隆抗体的早期研究中已经提出(Bussiere，T.，Acta. Neuropathol.97(1999)221-230)。然而，直到现在还一直没有该磷酸化表 位的高亲和力、高选择性单克隆抗体。这样的抗体必须能够在非磷酸化tau 以及在其它病原性和非病原性表位上磷酸化的tau的高背景中识别在 Ser422处磷酸化的tau。高度的选择性对于允许清楚区别AD中的病理性 和非病理性事件是至关重要的。

许多出版物都指向单磷酸化表位即磷酸-Ser422在tau病理发展中的 重要性。

另外，来自NFT或正常脑的tau质谱分析显示该磷酸化表位是 PHF-tau所独有的(Hasegawa，M.，J.Biol.Chem.267(1992)17047-17054， Cripps，D.，J.Biol.Chem.281(2006)10825-10838)。