[发明专利]鸡马立克氏病毒感染检测抗原的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及禽病检测试剂领域，尤其是鸡马立克氏病毒感染检测抗原的制备方法。

背景技术：

马立克氏病(MD)是世界上首例通过疫苗控制的倍受兽医界、医学界和生物界关注的致瘤性和免疫抑制性传染病，其病原为马立克氏疱疹病毒(MDV)。MDV是细胞结合性病毒，其有三个血清型，从温和型到毒力很强的致瘤株以及它们的致弱株，均归为血清1型MDV，天然不致瘤的病毒株为血清2型，火鸡疱疹病毒(HVT)属于血清3型；三个血清型中只有血清1型中的强毒株对鸡有致瘤或致病性。由于该病严重损害鸡免疫系统，除本身可招致长达数月及累计高达70％以上的致死率外，该其间，常导致各种“鸡瘟”疫苗的免疫失败或继发感染而造成重大损失。鉴于MDV污染严重，毒力不断增强，加之MD致瘤潜伏期长和隐蔽性极强，即使免疫后也不能阻断其侵入与传播，因此，MDV强毒污染监测不仅是MD防制的源头，也是确保其它禽用疫苗免疫效果的前提和评价养禽生物安全状况有效方法。

检测鸡群MDV强毒感染的方法有多种，如病毒的分离与鉴定、血清学检查及MDV特异DNA的检测等。MDV的分离与鉴定，虽有其特别的用途，但其分离的难度较大，易受污染的影响且费时，故不适于常规检测和流行病学调查。MDV分子水平的特异性检测，如核酸探针和聚合酶链反应(PCR)，虽然由于其特异性强、敏感性高等优点已成功地用于MDV的检测，但其严格的物质技术条件限制和高昂的检测费用，因而难以推广和普及。

鸡MDV强毒感染的血清学检查，特别是琼脂凝胶免疫扩散试验即简称为琼扩试验，因特异、敏感、简便、直观和可重复性强及检测费用相对低廉而广泛应用(NY/T 905-2004)。其主要是用标准MDV阳性抗原和MDV阳性抗体，来检测鸡群体内有无明显反应性的MDV抗体和/或MDV抗原，从而得出鸡群是否有MDV强毒的感染或污染。目前，国内外制备的MDV阳性琼扩抗原，主要是源于MDV强毒细胞培养后的感染细胞及其培养液，或是源于MDV强毒感染阳性鸡羽毛囊及皮肤，或可能源于MDV的A抗原基因(gC)的原核或真核表达产物。这种方法进行生产的主要缺点是都需要有细胞生长的条件与MDV强毒增殖的过程，或含目的抗原基因的原核或真核表达条件与过程等，从而才能在感染细胞中产生出MDV的病毒性抗原。同时，由于是MDV强毒的增殖，前两种制备方法始终存在着散毒的危险性，后者也须有一定生产工艺的要求，均必须对其生产过程进行严格的生物安全控制，因而进一步增加了生产成本。

由于MDV所产生的抗原成分十分复杂，为减少非目的蛋白抗原成分的干扰，提高目的蛋白抗原试剂的质量，对MDV感染细胞的抽提物、或感染细胞上清或工程表达液中的目的蛋白抗原进行分离纯化是基本的要求。利用免疫沉淀方法可从MDV的感染细胞抽提物中已鉴定出多达46种病毒特异性多肽，其中，通过琼扩试验能够鉴定出3个主要MDV抗原，并分别命名为MDV A抗原、B抗原和C抗原。A抗原由于大量表达而成为琼扩试验最易检出的MDV抗原。A抗原是一种可溶性糖蛋白，其为分子量57～65KD，由gC基因所编码，也称之为MDV gC抗原。A抗原存在于感染细胞的表面和细胞浆内，且能从感染细胞中分泌出来，因此，在感染鸡的羽毛囊(羽囊液)及皮肤、血清以及感染细胞及感染细胞上清中也都能够检测出来。MDV gC抗原与单纯疱疹病毒(HSV)gC同源，并与火鸡疱疹病毒(HVT)的gC有很强的交叉反应。

目前，MDV阳性琼扩抗原主要有以下二种制备方法。一种是源于MDV强毒的感染细胞或感染鸡羽毛囊及皮肤的MDV阳性琼扩抗原制备方法，即收集MDV强毒的感染细胞或富含羽液的阳性鸡羽毛根或羽毛囊及皮肤，加入适量的常规缓冲液(若是病毒感染细胞物，也可留适量的培养液来代替缓冲液)，经反复冻融与浸提或进行裂解后，提取其水溶物即可用作MDV阳性琼扩抗原。另一种是源于MDV强毒感染细胞的上清液或MDV A抗原基因(gC)的表达产物的MDV阳性琼扩抗原制备方法，则采用盐析沉淀法进行制备(可采用离心除杂的前处理)，即：取该上清液，通过一定的程序与方法加入特定的化学试剂如硫酸铵或其饱和溶液等，离心收集其目的沉淀物，再加入适量的溶液进行溶解或脱盐后，也可用作MDV阳性琼扩抗原。除此之外，MDV琼扩抗原其它制备方法尚未见报道。

发明内容：