[发明专利]一种提高牛乳中免疫球蛋白(IgG)含量的方法

说明书

免疫球蛋白(Immunoglobulin，简称Ig)，是人类及高等动物受抗原刺激后体内产生的 能与抗原特异性产生相互作用的一类蛋白质，又称为抗体，普遍存在于哺乳动物的血液，组 织液，淋巴液及外分泌物中。根据其理化性质尤其是免疫学性质，可将其分为5类，即IgG， IgA，IgM，IgD及IgE，牛体内以IgG为主。

本发明通过提高抗原释放剂ARD(Antigen Releasing Device)和免疫刺激复合物(ISCOMs) 的免疫原性和稳定性，扩大试验动物的样本含量，深入的研究ISCOMs疫苗对奶牛细胞免疫的 影响规律，重点检验牛乳中免疫球蛋白，为含高水平特异性抗体的免疫乳生产提供试验依据。

1、材料与方法

1.1样品：抗原释放剂ARD(Antigen Releasing Device)

选用澳大利亚Agri-BIOTECH公司生产的抗原释放剂ARD(Antigen Releasing Device)， 免疫刺激复合物(ISCOMs)以不同浓度的聚交酯胶囊包被，分别在埋植后的0d、14d和28d 释放出免疫刺激复合物引起奶牛的免疫应答产生免疫球蛋白。埋植枪及ARD设计示意图见附 图1。

1.2动物：

在北京市大兴区沧达福奶牛场选择泌乳前期的成年健康荷斯坦奶牛，以隐性乳房炎诊 断液进行乳房炎检测剔除隐性乳房炎病牛，并根据其产奶量、年龄、胎次、泌乳阶段选择40 头奶牛并分组，免疫组20头(编号No.1～20)，对照组20头(编号No.21～40)。参试奶牛 状况见表1。于2006年11月16日对免疫组的20头牛进行埋植ARD，埋植位点在奶牛骻内淋 巴结处，每头牛埋植3种不同ARD，试验期为4个月。

表1试验奶牛状况

1.3试验牛饲养管理及样品的采集：

试验牛饲养管理按牛场的正常饲养管理程序进行，采用中产奶牛饲料配方，TMR饲喂， 精粗比为45∶55，粮组成及营养水平见表2。奶牛自由采食，记录采食量，喂三次，饲喂时间 分别为7:00、14:00和20:00。挤奶三次，时间为7:00、14:00和20:00，采用Delaval鱼骨 式挤奶台进行机械挤奶，挤奶时“二次药浴，一次纸巾擦干”。观察奶牛健康状况，重点观察

埋植后7d内的伤口是否发炎。

表2试验粮组成及营养水平

0d～10d期间内，每2天记录每头牛的产奶量，于每天的固定时间测量每头牛直肠体温， 采集每头牛的乳样；21d～60d时每3天采集每头牛的乳样，每周记录采食量、产奶量和体温。 采乳样时每天采集乳样3次，按早中晚比例4∶3∶3混合，共取样100mL，4℃保存；50mL奶样 用于北京奶牛中心检测牛奶体细胞总数和乳脂、乳蛋白等常规成分；50mL奶样用于分离乳清。 每组固定10头牛用于采血(No.11～20；No.31～40)。采血时以采血针尾根动/静脉采血，分 别以真空抗凝采集管和真空促凝采血管收集血液。凝固的血液用于分离血清，分装于4个离 心管中-80℃保存待用。抗凝血分别用于MTT、流式细胞仪等检测。

同时采集沧达福牛场其他奶牛的初乳样品，每头分娩奶牛每24h采集1次奶样，每次采 集200mL以上，连续采集7d，用以分析比较免疫乳清和初乳乳清。收集乳样的同时采集抗凝 和促凝血。

1.4实验方法

1.4.1乳房炎和体细胞数检测

取50mL乳样以乳成分分析仪(型号：Fossomatic 5000、Milkoscan 4000)测定体细胞 数和乳脂率(Fat)、乳蛋白(Pro)、乳糖(Lac)、总固形物(TS)、非脂固形物(SNF)5项 常规成分。

1.4.2间接ELISA方法测定特异性抗Lipase的Ig

参照Guan Tay博士的方法，以Lipase Antigent包被酶标板捕获待检样品中的特异性抗 体，样品稀释倍数为1∶200，采用AP酶标驴抗山羊IgG作为二抗，p-NPP显色，测定特异性 抗Lipase的总Ig。FCS(胎牛血清)为阴性对照，以澳大利亚Agri-BIOTECH公司提供的2 个阳性乳清(牛号分别为168Q和460X)为阳性对照。

1.4.3夹心ELISA方法测定Ig和乳铁蛋白绝对含量