[发明专利]肿瘤靶向性腺相关病毒载体的构建和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因治疗领域，具体地说，是涉及一种特异性在肿瘤细胞内表达的靶向性腺相关病毒载体rAAV-hTERT-hTRAIL及其构建方法和应用。

背景技术

对于大多数种类的癌症，目前仍然采用的是传统疗法如外科手术、放疗、化疗等，而面对很多中晚期恶性肿瘤，传统疗法显得束手无策，主要表现在治愈率低、复发率及死亡率高、预后较差。基因治疗是通过改造基因来治疗疾病的一种生物高技术方案，人们对肿瘤的基因治疗寄寓极高的热情，66％的基因治疗临床试验均用于肿瘤治疗。到目前为止，肿瘤的基因治疗研究已取得了重要进展；对于恶性肿瘤，基因治疗可利用肿瘤细胞与正常细胞间分子水平的差异，显著拓宽肿瘤的“治疗窗”，能高效地、选择性地杀伤肿瘤细胞或阻止肿瘤细胞生长以及防止肿瘤的转移。

然而经过十多年600多个临床试验方案发现，尽管基因治疗是非常安全的，但其抗肿瘤效应却非常低，有的甚至无任何治疗作用，这主要是现阶段基因治疗载体的问题。目前的载体系统在人体内既不能特异性地转染所有的肿瘤细胞，也不能使治疗基因在肿瘤内高效表达，而且肿瘤的发生是包含多种基因改变的多步骤过程，通过单一基因的修饰很难彻底消灭肿瘤。这一系列问题严重阻碍着肿瘤基因治疗的临床疗效。因此研制高效、靶向转染肿瘤细胞的载体系统对目前肿瘤的基因治疗至关重要。

在目前被广泛应用的基因治疗载体中，病毒载体包括腺病毒(adenovirus，Ad)、腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒(retrovirus)和慢病毒(lentivirus)等最为常用。AAV由于具备以下特性而引人注目。第一，AAV引起的免疫反应轻微，病源性低，至今未有报道其引起人类任何疾病；第二，作为一种缺陷型病毒，在无辅助病毒感染时，只能整合在宿主细胞DNA中，呈“潜伏”感染状态；第三，可定点整合，AAV是唯一一种以位点特异性方式整合在人19号染色体上的真核病毒，从而避免随机整合而导致宿主细胞突变的潜在危险性；第四，宿主范围广，包括分裂期细胞和非分裂期细胞；第五，携带的外源基因可长期、稳定表达。因此，AAV成为目前基因转移最为理想的载体之一。然而，由于AAV2广泛的宿主范围和组织或细胞特异性的缺乏，使得其作为载体用于临床前和临床治疗试验时依然存在安全性、靶向性和转染效率低的弊端。因此，在AAV2成功用于肿瘤治疗的研究中，为了达到最大肿瘤杀伤效率和最小的细胞毒性，必须尽力克服这些问题，寻求AAV2载体介导肿瘤治疗的最佳靶向策略。

近来，以病毒治疗恶性肿瘤成了科学研究的热点，且取得了新的突破。最近临床实验使用的几种病毒，如腺病毒ONYX-015、CV706，单纯疱疹病毒G207和G1716以及逆转录病毒和腺相关病毒等，治疗效果令人鼓舞。这些病毒有的能够选择性的在肿瘤细胞中复制、增殖，杀死肿瘤细胞，释放出来的子代病毒扩散到临近的肿瘤细胞，在肿瘤组织内引起一种链式反应，最终消灭全部肿瘤，而在正常细胞中不复制；有的进入体内后能够使介导的治疗基因特异性的在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达；还有的病毒自身蛋白具有阻止肿瘤细胞周期进行、抑制肿瘤细胞增殖及防止肿瘤发生的作用。

实施肿瘤的靶向性基因治疗，首先要构建能够介导治疗基因特异性的在肿瘤细胞中表达、而对正常细胞无损害的病毒。因此，需要对腺相关病毒载体进行改造，利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因，从而使治疗基因只在肿瘤细胞内特异性表达，而对正常细胞无损害；从而提高基因治疗的靶向性和疗效，使腺相关病毒载体能更有效安全的应用于临床。

利用肿瘤特异性启动子控制病毒所携带的治疗基因是构建肿瘤靶向性腺相关病毒的方法之一，其能使治疗基因只能在肿瘤细胞内表达，而在正常细胞中不表达，从而大大降低了肿瘤基因治疗的副反应而增强了其靶向性和疗效。近年研究表明，端粒酶可能是迄今发现的一个最为广泛的肿瘤新标志物，在细胞永生化和肿瘤发生发展过程中起重要作用。在生理条件下，正常细胞大都没有端粒酶活性；而在85-90％左右的肿瘤细胞中端粒酶活性高。并且其活性高低与肿瘤的恶性程度相关，提示端粒酶可以作为肿瘤治疗的很好的靶点。端粒酶逆转录酶，即hTERT(human telomerase reverse transcriptase)，是端粒酶复合物的核心成分，其表达状态与端粒酶活性显著相关，是细胞调控端粒酶活性的关键环节。hTERT基因的表达主要是从转录水平上调节，在90％左右的肿瘤细胞中转录上调，而在静息期细胞中不转录。因此，hTERT启动子被用来控制外源基因的表达，可望提高肿瘤基因治疗的靶向性。