[发明专利]一种双启动子调控腺病毒蛋白的方法及用途

说明书

发明领域

本发明属生命科学领域，具体涉及一种用人端粒酶催化亚单位启动子和一段环氧化酶2启动子调控腺病毒早期蛋白的方法及用途，利用这两段启动子分别调控腺病毒的早期基因E1A和E1B，使这种重组腺病毒只能在具有端粒酶活性并表达环氧化酶2的肿瘤细胞内特异性地增殖，而在非肿瘤细胞内基本不增殖。

背景技术

恶性肿瘤已严重地危害了人类的健康，在工业化国家，每五个人中就有一个死于和癌症相关的疾病。目前，治疗恶性肿瘤的方法还主要集中在手术、化疗和放疗这三类常规手段，但这些方法对很多恶性肿瘤的治疗效果不甚理想。手术治疗方法只能针对于肉眼可见的肿瘤，很多已有远处转移的晚期肿瘤均是没有手术机会的。对于化疗药物来说，绝大多数化疗药物的治疗剂量和毒副剂量比较接近，因此在杀死肿瘤细胞的同时也带来了较强的毒副作用，包括骨髓抑制等。放疗治疗恶性肿瘤的效果仅局限于几类恶性肿瘤，适用范围不够广泛，也有较大的副作用。因此，研究选择性地杀灭肿瘤细胞的有效方法将是今后治疗肿瘤的方向，而基因治疗作为一种安全性高、可控性强的治疗手段，正引起人们极大地关注。把治疗局限在肿瘤细胞的一个主要思路是依赖于肿瘤细胞的特异性标记，其疗效也决定于该特异性的肿瘤标记能否严格限制在肿瘤细胞内。

近十年来，随着病毒学、分子生物学和肿瘤学的飞速发展，人们已经完成了对多种病毒的全序列的测序工作，并对其基因的结构及其功能进行了较为详细的研究，能有效地对病毒基因进行改造，改造后的病毒对肿瘤细胞的感染、复制增殖和溶解细胞的能力有效增强，而对正常细胞这种能力减弱甚至消失，因此这种病毒能在肿瘤细胞内进行选择性复制，当病毒感染肿瘤细胞后可数千倍甚至数万倍增加病毒的数量，从而裂解肿瘤细胞，释放出新的病毒，再次感染肿瘤细胞，再次复制增殖，直至将全部肿瘤细胞杀灭，由于这种病毒不能在正常细胞内增殖，故对正常细胞影响不大，这种肿瘤细胞特异性增殖病毒称为肿瘤增殖病毒，目前已有几类进入了临床试验。

端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短，即端粒减少50-200个核苷酸，当端粒缩短至一定程度，会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，使肿瘤细胞分裂所致端粒的缩短进一步延长，从而维持染色体的稳定，使细胞逃逸死亡而获得永生，最终导致肿瘤细胞不断增殖，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中其关键作用。端粒酶在大约90％肿瘤细胞均阳性，而极大多数正常细胞端粒酶均为阴性，因此端粒酶可作为肿瘤细胞一种特征性标记。人的端粒酶由三部分组成：RNA组分(hTERC)，端粒酶结合蛋白(TEP1)，端粒酶催化亚基(hTERT)，其中端粒酶催化亚基在端粒酶活性中起决定作用，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中端粒酶催化亚基呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达。因此端粒酶催化亚基启动子在极大多数肿瘤细胞内呈激活状态。

环氧合酶-2(Cox-2)和端粒酶一样在正常组织基本上不表达或低表达，而与许多恶性肿瘤紧密相关，现已证实环氧化酶-2在多数的甲状腺、胃肠道、乳腺肿瘤中表达均明显增高，如85％的结肠癌和大部分的胃癌(包括原发灶和转移灶，环氧化酶-2表达均特异性增高)，因此，环氧化酶-2启动子也可以作为肿瘤细胞的特异性标记。

因此，综合上述背景，我们利用了端粒酶催化亚单位启动子和环氧化酶-2启动子双重调控腺病毒的早期必需基因E1A和E1B，使这种重组腺病毒只能选择性地在同时有端粒酶催化亚单位和环氧化酶-2基因表达的肿瘤细胞内特异性地增殖，并把它作为一种新型的肿瘤基因治疗方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用双启动子调控腺病毒蛋白的方法，是利用人端粒酶催化亚单位启动子和环氧化酶2启动子，分别调控腺病毒早期基因E1A和E1B。具体为：用Age I单酶切，并把人端粒酶催化亚单位启动子插入到腺病毒载体pXC1的E1A前启动子区域，用Eag I单酶切，并把环氧化酶2启动子插入到腺病毒载体pXC1的E1B前启动子区域，把人端粒酶催化亚单位启动子和环氧化酶2启动子同时插入到一个腺病毒pXC1载体上，分别调控腺病毒早期基因E1A和E1B。

本发明的另一个目的是双启动子调控腺病毒蛋白的方法在制备调控腺病毒早期基因E1A和E1B的肿瘤基因药物中的应用。实验证明，这种重组腺病毒能选择性地在表达端粒酶和环氧化酶2的肿瘤细胞内增殖并杀伤肿瘤细胞，而在正常细胞内不增殖。