[发明专利]从未经发芽的豇豆干种子中直接快速提取DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于作物品种种子鉴定的方法，尤其涉及一种从未经发芽的豇豆干种子中直接快速提取DNA的方法，属于种子真实性和纯度鉴定的技术领域。

背景技术

豇豆(Vigna sinensis L.)，又名豆角、带豆、黑脐豆等，属于豆科，蝶形花亚科的一年生草本作物，原产于亚洲东南部热带地区，不仅是夏季、秋季重要的蔬菜种类，也是高蛋白的粮用作物，在全国广泛种植。

随着科学技术的进步，农业生产技术的发展，越来越多的优良品种为农业高产、稳产做出了重大贡献，高产、优质、抗病的优良品种越来越受到广大农民的欢迎。近年来，一些不法分子为追求经济利益频频购销假冒伪劣种子，致使农业减产甚至绝收，给国家和农民造成了重大经济损失。因此，种子的质量问题(特别是纯度)必须予以高度重视。世界各国对种子质量都极为关注，制定了一系列的检验规程和质量标准，以确保种子质量。品种真实性和纯度鉴定是种子生产工作中不可缺少的重要步骤，是保证良种优良遗传性充分发挥，促进农业生产持续稳产、高产的有效措施；是防止良种混杂退化，提高种子质量和产品质量的必要手段；是克服盲目引种、调种，避免品种混淆和差错的重要环节；是正确评定种子等级、贯彻优种优价政策的主要依据。总之，品种的真实性与纯度鉴定对种子工作和农业生产起了巨大的推动和保证作用。因此，对豇豆品种进行种子真实性的快速鉴定研究，对于保护育种者的权利、打击假冒伪劣蔬菜种子以及保证种子质量，服务种子种苗工程以及蔬菜生产的稳定和发展均具有重要意义。

豇豆品种真实性的传统鉴定方法主要包括以田间种植鉴定法、形态特征和以指纹图谱的建立为基础的鉴定方法。田间种植鉴定所耗费的时间长、费用高，且不能在种子种植以前确定其真实性，而种子形态鉴定法存在应用范围相对较窄，可靠程度相对较低的问题。在生化指纹图谱鉴定法中，贮藏蛋白电泳指纹图谱存在亲缘关系较近的品种间贮藏蛋白差异不明显和可利用的蛋白质种类十分有限的问题，而同工酶指纹图谱的缺陷是它往往具有器官、组织的特异性。DNA指纹图谱基本上克服了以上鉴定方法的缺点。目前，随着杂种优势的利用，当前推广的蔬菜品种多数为杂交种子，由于有限的亲本资源，随着杂交品种的不断涌现，品种间尤其是杂交种子间的遗传差异越来越小，这使得蔬菜品种的真实性与纯度鉴定越来越难，而DNA指纹图谱以其所具有的的优越性可以进行很好的鉴定。

DNA分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种新的遗传标记形式。它是建立在DNA序列多态性基础之上，是基因的直接反映。与经典的遗传标记相比，DNA标记具有：①极大的丰富性。从理论上讲，DNA水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何差异，包括单个核苷酸的差异，因而DNA标记的数量几乎是无限的，这是同工酶和蛋白质电泳技术所无法比拟的。②多态性高，变异类型丰富。③大多数DNA标记是共显性的，很容易区分杂合体和纯合体。④DNA标记对性状的表达没有影响。⑤DNA标记具有很高的稳定性，不受环境条件的影响，没有组织或器官的特异性，不受个体发育阶段的影响。

DNA分子标记检测种子真实性和纯度的主要优点是可靠，同时为便于在实践中应用，要求分析过程简单、快速、费用低。然而，目前被普遍采用的DNA提取方法大都采用幼苗叶片或者茎秆为材料，这些材料的准备首先需要将种子在一定的条件下发芽，经过一定时期的发芽生长过程才能得到所需的材料，不能满足种子真实性和纯度快速检测的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一从未经发芽的豇豆干种子中直接快速提取DNA的方法。加快DNA分子标记检测种子真实性和纯度的速度。采用本发明的提取方法提取所得的产物，经过DNA纯度、浓度的测定以及PCR和电泳过程的验证，显示提取DNA的方法和技术已经成熟，能为应用RAPD、SSR和ISSR等分子标记进行品种鉴定提供较纯的DNA材料。

包括如下步骤：

1)取1.5mL离心管装入1mL CTAB提取液，于60～65℃水浴下预热；

2)将一颗种子置于研钵中，冰浴中充分研磨，将研磨后的粉末转入预热的离心管中，剧烈振荡，置于60～65℃水浴中加热10～30min后于15～20℃，10000转/min离心10～20min；

3)取上清液转入另一1.5mL离心管，加入等体积的混合液，混合液中，苯酚、氯仿、异戊醇的体积比为25∶24∶1，反复上下颠倒离心管，充分混匀后于15～20℃，10000转/min离心10～20min，重复一次；