[发明专利]鮟鱇鱼皮中硫酸皮肤素的提取纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及动物体来源的生物医药的制备，具体为鮟鱇鱼皮中硫酸皮肤素的提取与纯化方法。

背景技术

硫酸皮肤素(DS)属粘多糖类化合物，是动物皮中最主要的糖胺聚糖，其分子主要由N-乙酰半乳糖胺4-硫酸与L-艾杜糖醛构成的双糖链组成，另外还有D-葡萄糖醛酸双糖链、N-乙酰半乳糖胺6-硫酸与D-葡萄糖醛构成的双糖链等。它具有较强的抗凝血活性，还有调血脂、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用。将其作为药物具有抗栓作用强，半衰期长的特点，与肝素相比，其突出优点在于没有出血副作用，病人耐受性好。经过近十年的实验药理研究和临床试验证明，硫酸皮肤素为一安全有效的非肝素类抗栓剂。

长期以来，猪皮是制备硫酸皮肤素的主要原料，也是商品硫酸皮肤素的主要来源。近年来用猪、牛肠粘膜、或牛肺分离肝素、硫酸乙酰肝素后的残液成为制备硫酸皮肤素的又一途径。然而，由于宗教信仰和人们对疯牛病及口蹄疫的恐慌，以猪或牛为原料制备硫酸皮肤素无法被所有人所接受，安全性也将受到质疑。

早在60年代，Clifonelli J A和Roden L等人(Biochemical Prep 12，5-12，1968)就曾利用猪皮为原料制备硫酸皮肤素。具体是采用木瓜蛋白酶降解后利用不同浓度的氯化十六烷基吡啶进行结合与解析得到硫酸皮肤素粗品，之后将粗品溶于水，以氢氧化钠和班氏试液沉淀，将沉淀溶于乙酸中，氢氧化钠中和后透析，透析液通过强酸型阳离子树脂脱铜，脱铜液以乙酸调至PH4-5，最后以2倍体积乙醇沉淀出硫酸皮肤素。

1996年，Voler(J Chromatogram B 685，27-34，1996)以牛肺为原料，以丙酮、三氯甲烷、甲醇等处理，木瓜蛋白酶和胶原蛋白酶酶解，离子交换树脂吸附、洗涤、洗脱，三氯乙酸除蛋白，多次沉淀、离心，干燥得到精致的粘多糖，混合粘多糖溶液中又通过添加不同体积的有机溶剂，如甲醇、乙醇和丙酮等，根据不同粘多糖的溶解性不同而将它们分离。

以上方法得到的硫酸皮肤素纯度高，但操作繁琐，难以用于工业化生产。目前还没有一种适合于工业化生产的硫酸皮肤素提纯方法。更少有人从鱼皮中提取硫酸皮肤素。

发明内容

本发明的目的是提供一种从鮟鱇鱼皮中提取纯化得到质量稳定的高纯度硫酸皮肤素的方法，同时解决鮟鱇鱼加工中鱼皮无法利用的实际问题，并针对目前大部分硫酸皮肤素来源于猪与牛的现状开发更有发展潜力的原料。

本发明以鮟鱇鱼皮为原料，要点是采用木瓜蛋白酶与胰酶组成的复合酶在合适的料液比、温度和时间下提取，在硼氢化钠的保护下加入氢氧化钠除糖肽，通过savage法除蛋白，再通过乙醇沉淀，沉淀溶解后透析除去离子及小分子，最后冷冻干燥得到高纯度硫酸皮肤素。

具体操作步骤如下：

①新鲜鮟鱇鱼皮经水洗后冷冻干燥，组织捣碎后得到干品原料；

②按干品原料与水的重量体积比为1∶20-1∶30计，在干品原料中加入蒸馏水，再加入木瓜蛋白酶与胰酶组成的复合酶，于50-75℃水浴加热提取13-19小时，冷却后离心，得到上清液为硫酸皮肤素粗提液；

③粗提液中加入固体氢氧化钠，再加入硼氢化钠，氢氧化钠与硼氢化钠在粗提液的终浓度分别为0.5mol/L与0.1mol/L，于30-50℃水浴反应20-30小时，离心取上清液，用醋酸调上清液PH值至6.5-7.0；

④加入体积为上清液体积1/3的除蛋白液，该除蛋白液组成按体积比为：正丁醇∶三氯甲烷1∶2.5-1∶4.5，充分摇晃15-30分钟后，室温静置分层，去除下层液体，保留上层清液；

⑤将上层清液按以上步骤④重复操作4次，得到去除蛋白液体；

⑥去除蛋白液体加入两倍体积乙醇，于4℃静置一天，收集沉淀；

⑦将沉淀充分溶于水，离心除去不溶成分，水溶液采用分子量为14000的透析袋除去离子及小分子物质，冷冻干燥后得到纯化的硫酸皮肤素。

以上步骤②中的复合酶的加入量为干品原料重量的1.0-3.5％，复合酶中木瓜蛋白酶与胰酶的重量组成比为1∶1-1∶3。

以上步骤进一步描述如下：

新鲜鮟鱇鱼皮经水洗后冷冻干燥，组织捣碎后得到干品原料。加入干品原料重20-30倍体积的蒸馏水，同时加入占原料重1-3.5％的复合酶，复合酶组成为木瓜蛋白酶与胰酶，其按重量的比例1∶1-1∶3(w∶w)，于50-75℃水浴加热提取13-19小时，冷却后离心，得到上清液为硫酸皮肤素粗提液。