[发明专利]一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物化工技术领域，涉及壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺。

(二)背景技术

壳聚糖是一种N-脱乙酰基葡萄糖聚合物，来源丰富，价格便宜，是甲壳素最重要的衍生物。壳聚糖具有无毒性、良好凝胶性、生物兼容性、蛋白质亲和性和金属离子螯合特性，是良好的固定化酶载体。以壳聚糖为载体的固定化酶种类有很多，如胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶、L-天门冬酰胺酶、β-甘露聚糖酶等。以天然壳聚糖为载体固定化酶主要缺陷是：因在偏酸条件下发生溶解，使固定化酶难以回收，其中大部分为粉末状，载体流速差，表面积小，限制其应用。因此目前的国内外研究主要集中在制备壳聚糖微球作为固定化酶载体，该载体具有吸附性能强，耐酸耐碱性能好等特性，从而克服了上述缺陷，是酶固定化的良好载体。

脂肪酶作为生物催化剂催化反应条件温和，产物颜色浅，副产物少且具有专一性，利于生产高质量的单甘酯、脂肪酸、甘油和其他种类的油脂产物，在工业上应用广泛。尤其是近年来在油脂生产中的应用，对生产绿色环保燃料，建设环境友好型社会，解决我国日益严重的能源问题，有着重要的现实意义和经济效益。但脂肪酶的价格较高，用游离脂肪酶进行反应时，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此造成产物成本较高且导致后续分离步骤困难，影响了脂肪酶在工业上的具体应用。通过对脂肪酶进行固定化，固定化酶在保持高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，大大提高了生产效益。

以壳聚糖微球为载体固定化脂肪酶的研究近年来备受关注。Tien-Chieh Hung等人利用磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶，酶活力达13.8 U/g；Shao-Hua Chiou通过两种壳聚糖微球来制备固定化脂肪酶，酶活回收率分别为75％和85％；吴茜茜等人研究了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件，对德氏根霉脂肪酶进行固定，并将该固定化酶用于酯的合成；陈盛等人以蟹壳为原料提取壳聚糖，用戊二醛作交联剂，将碱性脂肪酶固定于壳聚糖上；彭立凤等人研究了壳聚糖涂层在纤维素滤纸上成膜后再固定化猪胰脂肪酶的最佳条件。

我国目前大多采用单一方法固定，如吸附法或交联法单一固定化脂肪酶，由于载体形状的不规则性，固定化酶活力回收率普遍较低(36％-50％)及固定化酶对底物的亲和力低等不足之处限制了固定化脂肪酶的应用。针对此，我们以壳聚糖微球为固定化载体，先后利用壳聚糖分子上的羟基和氨基，采用戊二醛和碳二亚胺两次复合固定脂肪酶，提高固定化酶活力。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺。

为达到本发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的工艺按如下步骤进行：

(1)用戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶A：将假丝酵母脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液a中以壳聚糖微球为载体、采用戊二醛交联，制备得戊二醛交联固定化的脂肪酶A；

(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定化脂肪酶B：在用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液b配制的0.70～0.80mg/mL假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，搅拌3～8小时，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。

本发明所述步骤(1)为：用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液a配制的0.75mg/mL的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为2.0％～2.5％(g/ml)，续搅拌5～7时后，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A。

本发明步骤(1)中所述的壳聚糖微球有80％以上的微球的粒径在50～200nm。