[发明专利]L－色氨酸基因工程菌及其生产L－色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种L-色氨酸基因工程菌及其生产L-色氨酸的方法。

背景技术

目前，L-色氨酸的生产方法主要有四种：蛋白水解提取法、化学合成法、酶促转化法和直接发酵法。前2种方法分别存在着材料来源有限、需多步合成工艺和光学拆分及得率低、周期长等缺点，酶促转化法具有终产物积累量高、反应周期短、分离提纯容易等优点，它是生产L-色氨酸较为有效的方法。目前日本与我国企业多采用酶法生产。我国中科院微生物研究所余志华等采用重组DNA技术，成功地构建了能够高效表达用于酶法生产的色氨酸合成酶基因工程菌E.Coli.，并进行了规模化生产，但由于酶法底物之一L-丝氨酸价格昂贵，另一底物吲哚难溶于水，且对色氨酸合成酶抑制强烈，影响转化率提高，因此目前L-色氨酸的市场价格仍居高不下。

对L-色氨酸发酵工艺的研究始于60年代初期。虽然对这种方法的研究进行得比较早，但在相当长的一段时间内达不到工业化生产的要求，主要原因是从葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途径比较漫长，其代谢流也比较弱，而且L-色氨酸的合成需要多种前体物(如PRPP等)，另一方面，L-色氨酸生物合成途径中的调控机制也比较复杂。用传统方法诱变黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等出发菌株，解除菌体自身反馈调节，切断支路代谢，增加前体物的合成等，对芳香族氨基酸生物合成正常代谢机制进行调节，取得了一定成果，如：1982年日本杉本慎一等利用黄色短杆菌酪氨酸、蛋氨酸双重缺陷型兼对-氟苯丙氨酸抗性株，诱导5-氟色氨酸抗性株积累8.0g/L L-色氨酸，进一步赋予重氮丝氨酸抗性，积累10.3g/L L-色氨酸。1987年他们又从该株诱变出磺酸胍抗性突变株，在相同的培养条件下积累L-色氨酸18.8g/L。1987年日本仓桥等发现高浓度的L-色氨酸抑制枯草杆菌色氨酸生产菌生长，依次赋予该菌具有对以下各结构类似物5-氟色氨酸、吲哚霉素、重氮丝氨酸，6-重氮-5-氧基-L-正亮氨酸、肉桂酸的抗性，诱变得到了AJ-11982菌株，能从200g/L葡萄糖生产21.5g/L色氨酸。已知的L-色氨酸生产方法是基于一个突变的trpE基因的表达，该基因编码有色氨酸不敏感的邻氨基苯甲酸(anthranilate)合酶，以及基于在合适的可自动复制的载体上的trp操纵子的其他基因的表达。由于这些基因的相对高拷贝数，trpE基因的表达也多，对应的色氨酸代谢中的每一种酶的量也增加了，即可实现色氨酸的过量生产。

1979年Tribe和Pittard首次利用DNA重组技术将trpE引入E.coli中，色氨酸的产量达到1g/L。1982年Aiba et al将带有下调的trpE和trpD基因引入trpR和tnaA缺陷的E.coli中，在含有葡萄糖和邻氨基苯甲酸的培养基中培养，L-色氨酸的产量在27h时后为6.2g/l，同时他们还分离到一株抗6-氟色氨酸的突变株，以此菌株为出发菌株，同时引入增强表达得trp操纵子，通过发酵优化91h时产量达到50g/l。1993年Chan et al将三个拷贝的色氨酸操纵子基因整合到E.coli的基因组中，获得了稳定生产L-色氨酸的生产菌株，9.2g/l葡萄糖转化率13％，在没有选择压力的情况下也能稳定表达，因此将基因整合到基因组中获得稳定表达也是非常有用的策略。通过增强失调的trp操纵子在宿主菌中的表达来提高L-色氨酸的产量的在Berry(1996)和Camakaris et al(1997)也有所描述。随着重组DNA技术在微生物育种中的应用，在L-色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高方面出现了突破。例如从大肠杆菌EMS4-C25中分离得到抗反馈调节的色氨酸操纵子，并将其克隆到质粒pUC19和pHSG576中分别得到重组质粒pTC701和pTC576。将pTC576转化到大肠杆菌中，该菌经过17h的分批发酵积累色氨酸16g/L。Ikeda等将带有DAHP合成酶(DS)和色氨酸合成酶(F)的质粒引入产色氨酸的谷氨酸棒杆菌KY10-894中，使色氨酸的产量提高了54％，分批发酵100h左右达到了66g/L。基因工程育种在各种L-色氨酸生产菌中的成功实践说明其发展势头，也必将成为未来工业微生物育种的发展趋势。