[发明专利]一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA的方法，属于分子生物学和应用微生物学领域。

背景技术：

丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungus，AMF)是自然界中一类分布广泛的土壤微生物，它可以与约90％以上的陆生维管束植物的根系形成一种互惠共生体——丛枝菌根(Arbuscular Mycorrhiza，AM)。越来越多的研究表明根际土中大量的AMF根外菌丝在土壤生态系统中发挥着重要的生态学功能，发现土壤中AMF的种类和组成已成为影响植物群落定居、演替、植物区系组成的一个重要因素，进而也是影响生态系统中资源配置、生态系统的稳定性、物种多样性和生产力的重要因素。丛枝菌根表现出可以在不同组织水平上(Hierarchical Organizational Levels)影响生命系统的过程和功能。因此，AM已成为生态系统中一个重要的功能类群。基于菌根的古老起源及其分布的普遍性、生态功能的多样性和重要性，球囊霉门真菌国际菌种库(The International Bank for the Glomeromycota，BEG)管理委员会提出“严格地讲，自然界中的多数植物没有传统意义上的根系，只有菌根。因此，有关植物的研究如果不考虑菌根或者菌根的影响就不能全面反映植物生长的真实情况”。

因此，开展AMF群落结构特征及其生态分布调查研究一直是AM研究领域的一个热点。然而，由于AM真菌绝对活体营养这一生物学特性使得目前还无法对其进行传统意义上的纯培养，AM真菌这一特性极大地阻碍了AM真菌群落生态学的调查研究。自Simon等1992年首次报道了用特定的PCR引物对AMF的18S核糖体基因进行扩增得到AM真菌的第一条DNA序列以来，分子生物学这一有力工具在菌根研究领域初步显现出独特的魅力。因此，如何有效、快捷地从根际土或少量的新鲜根样中获得一定量的AM真菌目的DNA是开展AM真菌分子生态学及其应用研究的核心问题。

目前，从根际土(或植物根样)中获得AM真菌目的DNA的方法主要包括CTAB法、Chelex-100树脂法以及DNA提取试剂盒等。然而，以上三种方法都不能完全有效地解决从混有大量杂质的根际土中获得一定纯度的、有代表性的DNA。因此，从适量的根际土中获得AMF环境DNA对开展AMF分子生态分布特点研究显得尤为重要。

经文献检索，未发现与本发明内容相同文献的公开报道。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术之不足，通过发明一种快速提取植物根际土中AM真菌环境DNA方法，迅速扩增根际土中AM真菌目的DNA片段，从分子生态学层面上更准确、全面地了解AM真菌在根际土中的生态学地位和功能。

本发明利用根际土中AMF相关结构可以悬浮在水面的特点，结合CTAB法和Chelex-100树脂(Chelex-100resin，以亚氨二乙酸为吸附的苯乙烯与二乙基苯的共聚物)方法并加以改进，解决了从大量的(100g或更多)根际土样品中获得AM真菌环境DNA的问题。

土壤中存在许多影响PCR效率的制约因子，如何有效去除这些制约因子是开展土壤生物分子生物学研究的首要问题。本发明根据根际土中AM真菌通常可以形成较大的厚垣孢子且能悬浮在水表面的特性，采用湿筛沉淀法初步去除土壤中大部分PCR制约因子，收集根际土壤中AM真菌相关结构(如AMF厚垣孢子、AMF根外菌丝等)作为提取AM真菌环境DNA的样品，从而有效解决市售试剂盒只能从痕量样品提取DNA而缺乏代表性的不足(如美国EPICENTRE SoilMaster提取试剂盒，只能提取0.10g土壤)。通过湿筛倾析法收集到AMF孢子等结构经过CTAB试剂提取后，一方面，CTAB促进DNA的释放并减少机械破壁过程中如内源核酸酶对目的DNA的降解作用；另一方面，利用首轮有机溶剂(如等体积苯酚和氯仿混合液)初步去除大部分有机杂质，然后用Chelex-100树脂代替CTAB法中后续的多次有机溶剂的纯化过程。联合应用Chelex-100法及CTAB法可以有效地减少CTAB法在多轮有机试剂纯化过程中造成目的DNA片段损失。同时，由于CTAB法的引入可以促进目的DNA分子从大量样品中释放，并经过首轮有机试剂纯化后去除溶液中大量的蛋白质、脂肪等杂质。然后利用Chelex-100树脂对多价金属离子的整合作用，可防止DNA在煮沸加热时被降解，同时在高温低离子强度下还有催化DNA释放的作用，这样既可以减少DNA的损失，又可以消除扩增中的一些抑制因子。