[发明专利]一种编码β－酮酰辅酶A合成酶的水稻基因

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及与水稻表皮结构和生长发育相关的编码β-酮酰辅酶A合成酶的水稻基因，包括该基因的重组质粒、宿主及其应用。

背景技术

在植物体中，极长链脂肪酸(≥18C，very long-chain fatty acids，VLCFAs)及其衍生物是表皮蜡质、鞘脂、种子油和根部木栓质的重要组成成分。表皮作为植物与环境间的第一道屏障，由于有蜡质晶体覆于表面和无定形蜡质嵌入其中，能够减少非气孔水分蒸发，阻挡真菌、细菌、病毒和植食性昆虫等病虫害的侵袭，抵御紫外线、霜冻等的危害，对陆生植物起着重要的保护作用(Hamilton，1995)。

在质体中进行的脂肪酸从头合成途径(de novo synthesis pathway)是以脂酰CoA为受体(第一步的受体为乙酰CoA)、丙二酸单酰-ACP为C2供体，经过一系列连续的缩合、还原、脱水和再还原四步反应，生成链长依次增加2个碳原子的脂酰-ACP的过程，其最终产物是C16或C18的饱和脂肪酸(Buchanan et al.，2000)。更长链的脂肪酸，即VLCFAs，则是以C16或C18脂肪酸为前体进一步延伸而成的。

催化VLCFAs合成的脂肪酸延伸酶(fatty acid elongase，FAE)是定位于内质网膜上的多酶复合体，包含四种酶，即β-酮酰辅酶A合成酶(KCS)、β-酮酰辅酶A还原酶(KCR)、β-羟酰辅酶A脱水酶(HCD)和烯酰辅酶A还原酶(ECR)。在多酶体系的共同作用下，每轮缩合、还原、脱水和再还原反应的产物比起始酰基CoA的碳链延长2个碳原子(C2供体为丙二酸单酰CoA)。其中，由KCS催化的缩合反应是整个延伸反应的限速步骤，同时，KCS还决定着反应的底物特异性。

尽管早在20世纪60、70年代就开始了对植物VLCFAs合成的研究，但是，酶的疏水性使得常规生物化学方法难以分离，而且单纯的遗传学方法也没有从大麦、玉米、油菜、拟南芥等植物的缺蜡突变体中成功确定相关的基因位点，因而限制了对VLCFAs合成的了解。近年来，随着基因组学的迅速发展，突变体已成为研究植物基因功能最有力的工具。

在拟南芥中克隆到的第一个β-酮酰辅酶A合成酶基因是在种子中特异表达的FAE1(James et al.，1995)。fae1突变体种子中VLCFAs的总量大幅降低，成分分析发现是C18→→C22链延伸反应受到抑制。因此推测FAE1基因编码催化拟南芥种子中VLCFAs链长由C18延伸到C20和C22反应的缩合酶。随后，相继在加州希蒙得木(Lassner et al.，1996)和油菜(Barret etal.，1998)中克隆到种子中表达的缩合酶基因。加州希蒙得木的ScKCS基因和拟南芥的FAE1基因转化的油菜种子中VLCFAs的成分都有明显改变(Lassner et al.，1996；Katavic et al.，2000)，为油菜的定向育种奠定了基础。

在拟南芥基因组中进行搜索，找到21个序列可能编码β-酮酰辅酶A合成酶，KCS1(Todd et al.，1999)是其中之一。该基因在根、茎、叶、花、果荚、种子中均有表达，但以茎、花、根和5天时子叶中的表达量为高。其突变体茎杆较细，苗期对低湿度胁迫反应强烈。不同部位蜡质或木栓层VLCFAs组分分析能够发现某些成分的含量有明显变化，但链长变化不一致，因而不能确定KCS1催化哪一步或哪几步链的延伸反应。尽管蜡质成分有变化，但突变体并没有产生光亮表型，可能是该基因突变对表面蜡质的主要成分影响不大的原因。

cer6是拟南芥中发现的缺蜡光亮表型突变体之一(Millar et al.，1999；Fiebig et al.，2000)。CER6基因只在地上部分表达。其突变体茎杆、叶片及花粉表面的蜡质中＞28C的组分明显减少，而因过量表达CER6基因蜡质合成严重受抑制的拟南芥植株茎杆表面蜡质中24C组分有明显累积现象，由此推断CER6基因在24C→→28C链延伸反应中起作用。花粉表面蜡质成分的改变使cer6突变体的育性降低。

对器官融合型突变体fiddlehead进行基因克隆，发现FDH基因(Yephremov et al.，1999)与FAE1、KCS1、CER6、ScKCS和BnFAE在核苷酸水平上有54.5-56％的同源性，在氨基酸水平上有73-73.5％的保守性。FDH基因的突变不仅导致叶片和花等器官的融合，还阻碍了表皮毛的分化。进一步的功能分析表明，FDH基因参与的脂肪酸代谢反应是影响表皮细胞粘连和分化的原因。