[发明专利]一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体是一种利用发根农杆菌遗传转化高山红景天建立毛状根培养体系生产红景天甙的方法。

背景技术

高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)又名库页红景天，为景天科红景天属(Rhodiola L.)多年生双子叶草本植物。是珍稀药用植物之一，中医中具有“固本扶正”之功效，具有“适应原”的作用。还具有抗缺氧、抗寒冷、抗疲劳、抗微波辐射等显著功能，而且具有延缓肌体衰老、防止老年疾病等功效。由于高山红景天在工业方面的开发，野生植物大量被采挖，资源日趋枯竭。目前，当地政府已严禁采挖。自80年代初期，就开始人工引种栽培的研究，由于高山红景天适应高寒、干燥、高海拔的生长环境，不耐高温、潮湿气候以及易发病等原因，大面积栽培仍没获得成功。高山红景天主要药用成分为红景天甙。明海泉等报道利用其甙元醇进行糖基化反应人工合成红景天甙，但反应过程复杂，收率低。高山红景天细胞培养为红景天甙的生产提供了一条途径，但产量很低，培养细胞中的红景天甙含量至多只能达到野生植株的水平。许建峰等利用细胞培养，用于高山红景天次生代谢物生产研究，通过外界因子、前体物、诱导子以及细胞发酵的动力学研究，可使细胞培养密度最大达到18g DW/L，培养物中的红景天甙产量最大达到1980mg/L。相当于野生高山红景天中红景天甙的含量，况且，由于激素的添加不但增加成本，且影响红景天甙的品质。

由于毛状根具有生长速度快、分枝多、弱向地性，处于器官化水平，激素自养，生理生化、遗传特征稳定，有稳定的次生代谢物合成能力。大量培养毛状根替代野生资源，促进中药现代化发展。因此建立高山红景天毛状根培养系统大量培养具有重要意义。

自1997年Ackermann首先用发根农杆菌转化高等植物以来，迄今已有100多种植物建立了培养系统。并且利用其进行次生代谢物生产。中药有效成分大多在根部。而Ri质粒诱导产生的毛状根具有根的特性，且具有生长速度快、激素自养、分化程度较高，以及遗传性状相对地稳定等优点，因此，较细胞培养更有利于次生代谢物的大量生产。

发明内容

本发明的目的在于通过生物技术手段大量生产高山红景天毛状根，利用毛状根大量培养生产高山红景天甙，用以替代野生资源，填补中药缺口；本发明利用发根农杆菌遗传转化高山红景天获得毛状根，利用发酵罐大量培养毛状根用以生产红景天甙。

本发明是通过以下技术方案实现的：

以高山红景天(Rhodiola sachalinensis A.Bor)为外植体，利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes，Ar)进行遗传转化诱导产生毛状根(hairy root)，通过培养条件(pH值、温度、侵染时间、共培养时间和乙酰丁香酮添加)优化提高毛状根诱导率。毛状根经发酵罐培养大量生产毛状根，通过碳源、氮源、光照、温度、pH值、诱导子、前体物质和培养液的优化，提高高山红景天毛状根红景天甙的含量。通过毛状根红景天甙的分离提取过程，生产红景天甙。

该方法的具体步骤如下：

1、外植体的制备：将高山红景天的无菌种子置1/2MS培养基萌发，取3天苗龄的绿色子叶(留2mm左右的子叶柄)置于MS+0.5mg/LNAA+3.0mg/L 6-BA培养基上25℃继代培养。以在MS+1.2mg/L 2，4-D+2.4mg/L 6-BA培养基中暗培养2-4天的叶片、茎段和子叶节为外植体；

2、发根农杆菌培养：将发根农杆菌R1000或LBA9402或R1601或ATCC15834或A4(菌种均由法国园艺中心提供)在YEB固体培养基上活化，挑取单菌落，接种在LB液体培养基中，在27℃，4000r/min黑暗下摇床震荡培养，发根农杆菌菌液A₆₀₀为0.45～0.60时用于感染外植体。

3、侵染、共培养、毛状根诱导培养、除菌及筛选：将外植体分别侵入发根农杆菌菌液，黑暗中侵染20～30min；将侵染过的外植体置于MS+NAA(0.05mg/L)+Pro 700mg/L培养基上(培养基pH值为5.0～6.0)，于18℃～20℃共培养2～5天；移至1/2MS+卡那霉素50mg/L+头孢霉素450mg/L+50～100m mol/L乙酰丁香酮培养基上，光照培养2～5天，弱光培养诱导毛状根；将诱导产生的毛状根接入抑菌、筛选培养基1/2MS+Cef(500mg/L)+Km(50mg/L)保持弱光培养，每周转接一次，反复转接3～5次后；切下抗Km根系的2～5mm的根尖，接入液体培养基扩大培养。