[发明专利]高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒及构建

说明书

技术领域

本发明涉及生物工程技术和医药技术领域，特别是涉及一种能够高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒AcMNPV-ΔCC-SΔ(AcMNPV：Autographa californica MNPV)，还涉及该重组杆状病毒的构建方法。所述重组杆状病毒AcMNPV-ΔCC-SΔ命名为重组杆状病毒AcBac^ΔCC-S，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期是2007年5月18日，保藏号为：CCTCC NO：V200703。

背景技术

严重急性呼吸综合症(severe acute respiratory syndrome，SARS)的病原体被命名为SARS冠状病毒(SARS-CoV)，S蛋白是SARS-CoV的外壳组分，是SARS-CoV的主要表面抗原，也是病毒和宿主细胞受体结合及病毒诱发机体产生抗体或细胞免疫反应的重要因子。S蛋白属于I型膜蛋白，它是已知最大的膜结构蛋白，全长有1256个氨基酸(aa)，相对分子质量为139 170kD，其中1～13aa是信号肽，1197～1218aa有一段跨膜序列，是S蛋白和病毒外壳膜结合的位置。目前GenBank所收录的SARS病毒分离株的S蛋白的编码基因及氨基酸序列进行同源性分析发现：分离株S蛋白氨基酸突变率和编码碱基突变分别仅为0.23％和0.16％，是用来研制保护性疫苗的理想部位，进行多重比对显示，S蛋白的编码基因序列、S蛋白的特殊功能及其相对保守性为有效疫苗的开发奠定了很好的基础，尤其在生产疫苗时，S蛋白常作为首选抗原蛋白。

然而目前，在我国SARS感染后的免疫学诊断尚无完善的方法，具体研究中将S蛋白作为研究靶点还存在很多问题，尤其是在保证S蛋白免疫原性及高分子量S蛋白的纯化操作中还存在困难。目前针对同S蛋白相类似的高分子量的膜蛋白，大多选用技术已十分成熟的原核表达系统，但还存在许多原核表达难以克服的缺点，如原核表达系统的翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低；细菌产生的致热原致使表达产物难以应用于临床；目的蛋白常以包涵体形式表达，致产物纯化困难。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足进行改进，提供一种能够高效表达SARS-CoV近全长S蛋白的重组杆状病毒，其蛋白的表达量高、具有表达后修饰功能、表达的外源蛋白具有更好的抗原性活强，大大方便了大分子量及复杂的膜蛋白的表达及后续的纯化。同时基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统的原理，使得构建操作更简单和有效。

本发明解决其技术问题采用以下的技术方案：

本发明提供的高效表达SARS冠状病毒S蛋白的重组杆状病毒是CCTCC NO：V200703。

本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCC NO：V200703，其构建方法是：基于杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，利用改造的带有病毒AcMNPV自身的组织蛋白酶信号肽基因的转移载体pFastBacSHTa，将SΔ即由SARS-CoV WH20株S蛋白基因中去除了其1～13aa信号肽和跨膜序列以后序列31～3588bp的近全长S片段，克隆到pFastBacSHTa的多克隆位点上，使SΔ基因序列与6个组氨酸标签对框融合，从而获得新的转移载体质粒pFastBacSHTa-SΔ，再利用该质粒上的同源臂将其转座到双缺失的穿梭载体Ac-bacΔCC上，获得重组穿梭载体Ac-bacΔCC-SΔ，然后转染昆虫细胞，即可获得重组杆状病毒AcMNPV-ΔCC-SΔ，其为CCTCC NO：V200703。

本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCC NO：V200703的构建方法，其在进行下一步基于S蛋白的免疫诊断、疫苗研发或疾病治疗及研究方面中的用途。

本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCC NO：V200703的构建方法，其在对S基因的表达产物进行类似于哺乳动物体内的翻译后加工和糖基化修饰作用，使S蛋白的表达产物在结构及功能上更接近天然蛋白中的用途。

本发明提供的上述重组杆状病毒CCTCC NO：V200703的构建方法，在用于难以表达的外源蛋白中的用途，该外源蛋白包括膜结构蛋白，以及高分子量、修饰加工复杂的蛋白。

本发明利用杆状病毒Bac-to-Bac表达系统，通过构建杆状病毒穿梭质粒载体，利用昆虫细胞表达体系，提供了一种能够高效表达SARS-CoV近全长S蛋白的重组杆状病毒及其构建方法。与现有技术相比，本发明具有以下的主要优点：