[发明专利]人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体及构建和应用

权利要求书

1.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体，它具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，该序列含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的939个碱基。

2.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体的构建，其特征是采用以下步骤，包括：

(1)真核质粒表达载体的构建：

根据GenBank Acc.No：D49353，通过PCR扩增，获得人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子的cDNA，获得的PCR产物用DNA限制性内切酶EcoRI和HindIII消化后连于真核表达质粒pCDNA3.1(-)/Myc-His A上，

其中，PCR所用的上游引物p1、下游引物p2分别具有SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，即：

上游引物p1：5′-TGGAATTCATGGAGCTGGACAGAG-3′

下游引物p2：5′-ATAAGCTTGGCAGGTCGCACCTTCA-3′

在引物序列中划线的部分为EcoRI和HindIII的酶切位点；

(2)真核质粒表达载体阳性克隆的筛选和鉴定：

将已连接了人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白编码基因的真核表达质粒转化到大肠杆菌DH5α中，氨苄抗性筛选，挑取单个生长菌落，提取质粒，

用DNA限制性内切酶EcoRI和HindIII酶切提取质粒进行初步鉴定，酶切结果正确的质粒进行DNA测序，其具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备纤维胶凝蛋白分子中的应用，其特征是利用人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白真核表达载体和体外培养细胞制备人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子，方法是：

(1)在人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体转染前24小时，将1×10⁶个小鼠成纤维细胞STO细胞或结肠癌细胞CT26置于60mm的培养板孔中，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液在37℃、5％CO₂环境中培养；

(2)用lipofectamine^TM 2000(Invitrogen)转染试剂转染人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体到CT26细胞中，每一个60mm的培养板孔中转染8μg的质粒；

(3)将转染细胞培养48小时后，收获细胞并将细胞重悬于细胞裂解液中，37℃温育30分钟，细胞裂解液中即含有人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白分子，

细胞裂解液配方为：磷酸盐缓冲液中含有50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.02％NaN₃，0.5％NP-40，1％Triton X-100，1μg/ml胰蛋白酶抑制剂，100μg/ml苯甲基磺酰氟化物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是直接将人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒表达载体注射入动物体内，使人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白在注射的动物体内表达，具体方法是：用电转仪注射人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的真核质粒到小鼠肌肉第4、7、10天后，小鼠肌肉和脾脏组织中均可检测到纤维胶凝蛋白的表达。

5.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备用于人体自身的免疫制剂药物中的应用。

6.人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体在制备用于人体临床感染性疾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征是人L型补体凝集素纤维胶凝蛋白的表达载体用于沙门氏菌感染的药物中的应用。