[发明专利]一种蝴蝶兰查尔酮合酶基因,其编码序列和应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学、分析化学以及基因工程技术领域，具体涉及一种在蝴蝶兰中表达的查尔酮合酶(蝴蝶兰查尔酮合酶5，chalcone synthase，EC.2.3.1.74，phchs5)的基因克隆，此克隆的序列分析结果，基因表达模式分析结果，转基因载体的构建，转基因植株的获得以及相应的生理生化特性的鉴定。

背景技术

蝴蝶兰作为一种重要的经济型花卉，其花卉品质的优劣直接关系到其观赏价值与经济价值。花卉品质中尤为重要的是花色，随着基因工程的发展，运用分子生物学手段对花卉花色进行遗传改良成为研究热点。植物花冠的颜色由色素种类来决定，主要是黄酮类色素。苯基苯乙烯酮合成酶，即查尔酮合酶(CHS，chalcone synthase，EC.2.3.1.74)，催化类黄酮和花色素合成途径的第一步反应，是类黄酮类物质生物合成途径的限速酶。查尔酮合酶通常由植物中多基因家族编码，查尔酮合酶能在花中特异性表达，它在植物中表达量的改变可能影响花的颜色。目前多采用反义RNA技术对花卉品质进行改良，荷兰学者(1988)首先从矮牵牛中分离出CHS的cDNA，利用反义RNA技术，转化矮牵牛花后获得转基因植株。花色从原来的紫色变成粉红色并有白色，有些植株花全呈白色，这样矮牵牛花色增多，观赏价值得以提高(Elomaa等，1993)。Johzuka-Hisatomi等(1999)也从(牵牛)morningglories中分离出查尔酮合酶基因，并以反义和正义方向导入其中(开粉红色花)品种，得到开白花与淡粉色的转基因植株。以后相继报道了从多种植物中克隆了与花青素代谢有关的查尔酮合酶基因，并将它转入矮牵牛，获得的转基因矮牵牛花色发生了改变，出现了自然界没有的变异(Ryutaro等，2000a，200b)。

本发明研究了一种从蝴蝶兰中克隆催化生成查尔酮的查尔酮合酶(phchs5)，转入矮牵牛后改变花色素苷含量的技术。应用该技术对于改良蝴蝶兰以及兰科植物的花色品质、增加其品种的多样性具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从蝴蝶兰中克隆催化生成查尔酮的查尔酮合酶基因，其编码序列和应用。

本发明的一方面提供了一种新的蝴蝶兰基因phchs5，该基因是一个查尔酮合酶基因。phchs5包含1185bp的开放阅读框和一个159bp的内含子(GeneBank accession number：DQ089652)，其核酸序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一方面提供上述查尔酮合酶基因的蛋白质分子，该蛋白质分子具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸编码序列。

本发明还提供了用于调取获得蝴蝶兰样品中查尔酮合酶基因的核苷酸引物序列，为根据上述查尔酮合酶基因家族保守区域设计的兼并引物，及用于进一步扩增phchs5基因上下游序列的反式PCR引物，引物序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种利用转基因技术将编码具有蝴蝶兰查尔酮合酶活性的核苷酸序列转化入矮牵牛以改变花色素含量的方法，其步骤如下：

(1)将蝴蝶兰phchs5基因的开放读框连于植物表达调控序列，形成含有蝴蝶兰phchs5基因的植物表达载体；

(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同矮牵牛叶片共培养，在22±2℃条件下，暗培养3天后，通过抗生素筛选，植物组织再生，获得蝴蝶兰phchs5基因的转基因植株。含有蝴蝶兰phchs5基因的转基因植株的花色发生改变，花色素苷含量发生变化。

本发明还提供一种用于检测样品中蝴蝶兰查尔酮合酶基因拷贝数的方法，其步骤为：首先提取蝴蝶兰的基因组DNA。然后利用DraI和HindIII酶切。酶切后的DNA片段转膜并与前面所述核苷酸序列SEQ ID NO.1进行Southern杂交，然后检测目的片段的有无。

在本发明中，还提供了一种对phchs5进行结构分析、进化分析的方法，其步骤如下：运用ClustalX verl.8(Thompson等，1994)进行序列的同源性比较。MEGA2(Kumar等，2001)用于进化树[邻接法(Saitou和Nei，1987)]的构建，同时用于估计同义突变频率和反义突变频率(Nei和Gojobori，1986)。以RRTree软件(Robinson-Rechavii和Huchon，2000)进行相对速率检验(见图2)。

本发明还提供一种检测phchs5 mRNA表达模式的方法，其步骤如下：