[发明专利]一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物分析领域。

背景技术

日本血吸虫病是由日本血吸虫寄生在人或脊椎动物门脉-肠系静脉系统所引起的一种人兽共患寄生虫病，主要分布在中国、菲律宾及印度尼西亚等西太平洋地区的一些国家。估计目前有6.52亿人口受威胁，1.93亿感染者，有症状病例1.2亿。至2003年底，我国有血吸虫病病人84.3万人，晚期血吸虫病病人2.4万人，近几年报告病人数呈上升趋势。由于我国血吸虫病流行区人口众多，故血吸虫病仍然是我国重点防治的寄生虫病之一。

20世纪80年代中期，血吸虫病防治策略由消灭媒介螺蛳转向以化疗为主的综合性防治措施，因此，血吸虫病的诊断工作显得尤为重要。寻找简便、快速、价廉、便于在疫区推广应用、具有普查、临床实际诊断和疗效考核价值的检测方法，是当前迫切需要解决的问题。对血吸虫病的诊断，早期常采用病原学方法，但由于日本血吸虫在终宿主体内的寄生有着特殊的生物学关系，导致在慢性病患者和低度感染者的粪便中难以查见病原体，而且多数病原学方法操作繁琐，必须以更敏感和更简便的方法来替代或补充病原学方法的不足，因此血吸虫病血清学诊断方法得到迅速发展，先后建立了皮内试验(ID)、环卵沉淀试验(COPT)、间接红细胞凝集试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)等方法。

在众多血清学诊断方法中，基于胶体金标记技术的免疫学诊断方法是近年来新兴的一种简便快速的检测方法，由于它具有高度的特异性和敏感性，结果直观可靠，而且试剂和样品用量少，无需专业的技术人员，简化了繁琐的操作过程，是目前发展最快的免疫技术之一。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、灵敏、快捷的用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜及制备方法和应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜，包括硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上所吸附的血吸虫抗原和少量的聚乙烯吡咯烷酮、明胶和Tween 20。

一种制备所述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜的方法，包括以下步骤：

1、预湿：将硝酸纤维素膜浸入预湿液中，所述预湿液为含甲醇的磷酸盐缓冲液，室温反应完成后，再于室温下在真空干燥器中干燥；

2、加血吸虫抗原：用移液枪移取血吸虫抗原滴加到上述已预湿的硝酸纤维素膜上，室温反应完成后，再于室温下在真空干燥器中干燥，再重复一次；

3、封闭：将吸附了血吸虫抗原的硝酸纤维素膜浸入封闭液中，所述封闭液为含聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、明胶和Tween 20的磷酸盐缓冲液(pH 7.4)，室温反应1h，再于室温下在真空干燥器中干燥过夜；

4、保存：将制成的硝酸纤维素膜保存在4℃的冰箱中备用。

所述磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)含有10 mM NaH₂PO₄，10mM Na₂HPO₄和100mMNaCl。

一种利用所述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜检测血吸虫抗体的方法，包括以下步骤：

1、免疫反应：将血吸虫抗体和纳米金标记的二抗以相同的体积比混合，将上述用于检测血吸虫的硝酸纤维素膜浸入此混合溶液中；

2、清洗：充分反应后，将上述结合了血吸虫抗体和纳米金标记的二抗的硝酸纤维素膜先用0.5M的NaCl清洗，再用二次水清洗；

3、银染：将清洗后的硝酸纤维素膜浸泡在新鲜配制的银染溶液中，所述银染溶液为含AgNO₃，对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液，所述柠檬酸盐缓冲液(pH 3.5)含有0.243M柠檬酸(C₆H₈O₇·H₂O)，0.163M柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)，放置暗处于室温下温育，反应后将硝酸纤维素膜用二次蒸馏水清洗干净；

4、检测：将硝酸纤维素膜置于血吸虫光学诊断仪上，用CCD摄像头摄像，将数据采集输送至电脑中，读取灰度值，即相应的血吸虫抗体浓度值，灰度值与血吸虫抗体在10ng/mL～10μg/mL的范围内成线性关系。