[发明专利]一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞培养方法，尤其是一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，属生物技术领域。

背景技术

成人远端肺动脉平滑肌细胞，是研究肺循环相关疾病、尤其是肺动脉高压等疾病发病机制的重要细胞材料。目前培养肺动脉平滑肌细胞的方法包括酶消化法和组织块贴片法。动物来源多为大鼠，大鼠与人的种属不同细胞间差异较大，所以用成人的肺动脉平滑肌细胞进行肺动脉高压发病机制及相关研究的意义明显大于用动物的细胞。但由于取材困难，并且人类是高等进化的生物体其细胞在体外成功培养远远难于低等生物，同时因为成人细胞体外生长的潜伏期明显长于大鼠等动物所以体外成功培养更加困难。鉴于以上原因，目前国内用于实验研究培养的肺动脉平滑肌细胞多采用大鼠为材料；部分学者采用引产胎儿(18周内)的肺动脉主干进行实验。因为胎儿细胞增殖能力强易于培养，并且肺动脉主干平滑肌层厚细胞易于分离，但胎儿尚未发育成熟其细胞与成人细胞有所差异，而且肺动脉高压的主要病理改变部位位于肺远端动脉。所以采用胎儿肺动脉主干进行肺动脉高压机制研究的实验并不理想。而国外学者除采用动物为材料(大部分为大鼠)外；部分学者也购买成人的肺动脉平滑肌细胞株进行实验但细胞株价格昂贵并且非原代培养的细胞，细胞生物学特征有所改变影响实验结果；而少部分学者也培养成人远端肺动脉平滑肌细胞，但其采用的培养基为平滑肌细胞基础培养基(SMBM)这种培养基价格昂贵，国内一般的实验室难以接受。综上所述，寻找一种高效、简便、成本低的成人远端肺动脉平滑肌细胞原代培养的方法成为了实验成功的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法。该培养方法技术稳定，重复性好，培养的细胞形态均一，生长良好，且具有典型的平滑肌细胞的形态及特点。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种成人远端肺动脉平滑肌细胞的培养方法，它包括以下步骤组成：

(1)获取原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：从取得的成人远端肺动脉平滑肌层中分离远端肺动脉平滑肌细胞，并进行原代细胞培养。以获得原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞；

(2)获取传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞：当步骤(1)中的原代细胞长至对数生长期后，取出原代细胞用PBS(磷酸盐缓冲液)溶液清洗后，加入0.3～0.5ml 0.1％～0.2％胰蛋白酶溶液35～37℃消化2～3分钟，当细胞出现回缩、细胞间隙增大时，吸除胰蛋白酶溶液，加入3～5ml完全培养液，使之形成细胞悬浮液，接种于新的培养瓶中，每3天换液一次，即完成传代细胞培养，获得传代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。

所述的步骤(2)中的完全培养液为；胰蛋白酶溶液中含有0.1％EDTA(乙二胺四乙酸)，所述的细胞接种密度为2～3×10⁵个/ml，以保持细胞生长有足够的空间、营养。

步骤(2)中所述的完全培养基是：含90～105U/ml青霉素、90～105mg/ml链霉素的低糖DMEM(Dulbcco′s Modifed Eagle Medium)和胎牛血清的混合溶液，所述的胎牛血清占培养基总体积的10～20％。

所述的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)：含125～135mol/L氯化钠、3～6mol/L氯化钾、1～1.5mol/L氯化镁、5～15mol/LHEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)、15～25μmol/L氯化钙、5～15mol/L无水葡萄糖、90～105U/ml青霉素和90～105mg/ml链霉素的水溶液，该溶液的PH值为7～7.5。

所述的步骤(1)获取原代培养的成人肺动脉平滑肌细胞的具体步骤为：

1>采用分次酶消化法，将分离并剥离了内外膜的血管中膜组织剪成小块，放入HBSS中4℃静置20～30min，然后放入无含钙的HBSS中室温静置10～20min；再将组织块放入离心管中加入消化液35～37℃消化35～45min，可见组织块松软、边缘发毛。

2>吸出消化液，向离心管中加入完全培养基2～3ml，室温放置3～5min；广口巴氏吸管吹打10～15次，静置片刻使组织块沉淀，吸出细胞悬浮液收集于另一离心管中，再将原消化液加入原离心管中进行再次消化并按以上步骤收集细胞；将收集的细胞悬浮液离心，弃上清液，加入完全培养基调整细胞密度并以该密度种植于培养板中，置37℃、5％CO₂培养箱内静置培养，3d后半量更换培养基；当细胞生长至对数生长期，便获得了原代培养的成人远端肺动脉平滑肌细胞。

所述步骤2>中依据组织消化的情况，重复收集细胞操作2～4次。