[发明专利]镉离子间接竞争ELISA的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及水产类肉食品的重金属残留的一种快速诊断方法，具体是利用抗重金属镉离子的单克隆抗体对镉离子进行检测的间接竞争ELISA方法。

背景技术

镉(Cdmium)原子序数48，是严重危害人类健康的重金属之一，主要来源于镉矿、镉冶炼厂。因镉与锌同族，常与锌共生，所以冶炼锌的排放物中必有ZnO，CdO，它们挥发性强，以污染源为中心可波及数千米远。随着我国工农业的迅速发展，环境中重金属的污染越来越严重。重金属污染引起的毒害持久存在，会随土壤、水体再次循环而进入食物链，对食品安全构成威胁，危害人类生命和健康。镉中毒能使肾功能受到破坏，镉进入呼吸道可引起肺炎、肺气肿作用于消化系统则引起肠胃炎。镉中毒者常常伴有贫血，骨骼中有过量镉积累会使骨骼软化、变形、骨折、萎缩，还会引起癌症。我国各类食品中重金属的国家限量卫生标准，农产品安全质量无公害水产品安全要求(2001)中对镉含量都有限定≤0.1mg/kg。欧盟，美国，日本，韩国等我国水产品的主要出口国对水产品的重金属含量的限定也越来越严格，法规和标准也越来越苛刻。

目前重金属镉的检测方法主要有：

物理和化学的方法：原子吸收分光光度法(AAS)，电感耦合等离子体-原子发射光谱法(ICP-AES)，电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)，原子荧光光谱分析(AFS)等。这些方法的特点是灵敏、准确，但是需要复杂的仪器设备，专门的分析技术人员，且标准品价格昂贵，前处理麻烦，不能同时检测大量样品，不适合现场及大规模的推广应用。

免疫学检测技术：目前较多应用于重金属镉检测的是酶联免疫吸附检测法(ELISA)，其检测的原理是将镉离子与载体蛋白偶联免疫动物，获得针对镉的抗体，利用样品中的镉离子与标准品中镉离子竞争结合抗体并以此对样品中的镉进行定性或定量分析。该法简便、快速，可同时分析大批量样品。

目前国外已开展重金属的免疫学检测技术，成功地制备出In(III)、Pb(II)、Ni(II)、Cd(II)、Hg(II)等特异性重金属抗体，部分抗体已应用于环境检测，研制出重金属的酶联检测试剂盒。国内尚未有重金属的免疫学检测的报道，国外文献报道不充分，依据其不能重复合成人工抗原，因此开发具自主知识产权的重金属的酶联检测方法有重要意义。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用重金属镉单克隆抗体检测镉离子的间接竞争ELISA方法，该方法可以大规模地对海洋鱼贝类食品中残留的重金属镉进行快速、灵敏的检测，保障我国海产品食用安全及维护我国在相关国际贸易领域中的利益。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，包括如下步骤：分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的镉离子(Cd²⁺)标准液加入到抗原预包被条的微孔中，再加入抗镉离子的单克隆抗体到每个微孔，混匀孵育，在每个微孔中加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，孵育；经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各孔的吸光度(OD)，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中镉离子(Cd²⁺)的含量。

上述镉离子间接竞争ELISA的检测方法，包括如下步骤：

(1)在抗原预包被条的每个微孔内分别均加入10μl的100mM EDTA(乙二铵四乙酸)，然后在上述每个微孔中再分别加入80μL鱼贝类样品提取液及80μl系列浓度的Cd²⁺标准液，混匀；然后每个微孔加入10μL 1∶32000倍稀释的抗镉离子的单克隆抗体；混匀，37℃孵育0.5～2h；然后用洗涤液洗涤微孔；

(2)每个微孔加入100μL用稀释液1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5～1h；然后用洗涤液洗涤微孔；

(3)每个微孔加入100μL显色液TMB(3，3′，5，5′-四甲基联苯胺)底物工作液，反应10～20min；

(4)每个微孔加入50μL 2M H₂SO₄(终止液)终止反应，并振荡混匀；

(5)用酶联读数仪测定在450nm波长下的OD(吸光度)值；