[发明专利]镉离子间接竞争ELISA的检测方法

权利要求书

1.一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于包括如下步骤：分别将鱼贝类样品提取液和系列浓度的镉离子标准液加入到抗原预包被条的微孔中，再加入抗镉离子的单克隆抗体到每个微孔，混匀孵育，在每个微孔中加入HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，孵育；经底物显色后终止反应，用酶标仪测定各微孔的吸光度，对照标准品所得的曲线回归方程，计算样品中镉离子的含量。

2.根据权利要求1所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)在抗原预包被条的每个微孔内分别均加入10μl的100mM EDTA，然后在上述每个微孔中再分别加入80μl鱼贝类样品提取液及80μL系列浓度的Cd²⁺标准液，混匀；然后每个微孔加入10μL 1∶32000倍稀释的抗镉离子的单克隆抗体；混匀，37℃孵育0.5～2h；然后用洗涤液洗涤微孔；

(2)每个微孔加入100μL用稀释液1∶4000稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，37℃孵育0.5～1h；然后用洗涤液洗涤微孔；

(3)每个微孔加入100μL显色液TMB底物工作液，反应10～20min；

(4)每个微孔加入50μL终止液2M H₂SO₄终止反应，并振荡混匀；

(5)用酶联读数仪测定在450nm波长下的吸光度；

(6)将所得标准液和样品吸光度值除以0标准的吸光度值再乘以100％，以此标准液计算值为纵坐标，镉离子浓度的对数为横坐标绘制标准曲线；根据每个样品的B/B₀值从标准曲线上读出对应的镉离子浓度，再乘以相应的稀释倍数，计算出样品中实际的镉离子浓度；所述稀释液及洗涤液均为PBS-T即含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液。

3.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于：所述鱼贝类样品提取液按下述方法预处理：每克鱼肉或贝肉样品加入2mL乙酸乙脂，充分打碎匀质；4000rpm/min离心10min，取上清在50℃水浴下氮气流吹干样品；以等体积环己烷和蒸馏水混合提取涡漩1min，取环己烷层，每克样品加入12.5μL 1M HCl，再涡漩1min，静置30min；加入2倍HCl体积量的蒸馏水，8000rpm/min，弃去上层环己烷，吸取下层清液，用1N NaOH调整到pH7.0～8.0，用稀释液稀释10倍后，即得鱼贝类样品提取液。

4.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于：所述抗原预包被条是按下述方法制备的：

(1)包被：用包被缓冲液即pH9.6的0.05M碳酸钠缓冲液将Cd-iEDTA-BSA稀释至0.2μg/mL，每微孔100μL加入到聚苯乙烯微孔板孔中，4℃包被过夜或37℃包被2～3h；所述Cd-iEDTA-BSA是用iEDTA将镉离子偶联到载体蛋白BSA上获得的；

(2)洗涤：倒出微孔板孔中包被缓冲液后，将200μl洗涤液加入每个微孔中；3～5分钟后再次倒出孔中的液体，完全除去微孔中的液体；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M磷酸盐缓冲液；

(3)封闭：在微孔板每微孔加入150～200μL含0.5％～3％BSA的0.01MPBS，37℃封闭0.5h～1.5h；

(4)按步骤(2)洗涤微孔3～5次；

(5)加入20％蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时；

(6)干燥：微孔板干燥后，即得到抗原预包被条。

5.根据权利要求2所述的一种镉离子间接竞争ELISA的检测方法，其特征在于所述抗镉离子的单克隆抗体按下述方法制备而成：用iEDTA将镉离子偶联到血蓝蛋白上，混合弗式不完全佐剂免疫BALB/c小鼠，取免疫小鼠脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌抗镉离子单克隆抗体的阳性细胞株并扩大培养，注射细胞进小鼠体内诱生腹水，纯化获得抗镉离子的单克隆抗体。