[发明专利]诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞分化，具体涉及一种诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法。

背景技术

我国是继印度之后的第二位糖尿病高发人群大国。以往治疗糖尿病，服用药物和注射胰岛素是常用的方法，但是服用药物和注射胰岛素不仅会带来沉重的经济负担，而且会引起严重的并发症；近年来，移植胰岛治疗糖尿病初见疗效，但面临着组织来源不足和免疫排斥反应两大难题。干细胞研究给糖尿病患者带来了新的希望，其中胚胎干细胞多向分化潜能最强，几乎可以分化为包括胰腺β细胞在内的所有成体组织细胞，但其面临着伦理学的争议，并且具有致瘤性和较强的免疫原性，这些因素限制了其临床应用；胰腺干细胞是最有潜能向β细胞分化的成体干细胞，但其难以分离、扩增并且具有较强的免疫原性。成体骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)容易进行体外分离、扩增和纯化，并且可取自患者自体，能解决细胞来源和免疫排斥问题，但其向胰腺β细胞分化的效率较低，分化细胞的胰岛素分泌量少而不稳定。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点和不足，本发明提供一种诱导人胎肝间充质干细胞(mesenchymal stem cells derived from human fetal liver，hFL-MSCs)向胰岛β样细胞分化的方法。本发明的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法包括以下步骤：

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细胞；然后将肝间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗，再用胰酶进行消化处理，然后首次按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养；

(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：取步骤(1)中第3代以后的达到80％～90％融合的hFL-MSCs，消化、接种、再用诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团。

步骤(1)所述的完全培养基优选含100mL/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/LHEPES的DMEM/F12培养基。

步骤(1)所述的接种培养优选如下接种培养方法：将细胞按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞；以后每2～3d换液1次。

步骤(1)所述用胰酶进行消化处理优选如下处理过程：加入质量浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃继续消化1～5min，然后加入含100mL/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/LHEPES的DMEM/F12培养基终止消化；

步骤(2)所述的消化、接种、再用诱导液培养优选以下处理过程：用质量浓度为0.25％的胰酶消化细胞，按1∶2比例接种于25cm²之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液，经诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团；其中，所述的诱导液为含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF及3％-5％FCS的IMDM培养液。

本发明所述的人胎是指已死亡的离体胎儿，胎儿时期的MSCs因为增殖能力更强，可塑性更好，且免疫原性低，无成瘤性，因而具有显著的优越性，在体外将其初步诱导为能分泌胰岛素的胰岛β样细胞，胰岛β样细胞可进一步用于制备治疗糖尿病的药物。因此，该领域的研究具有广阔的临床应用前景，可带来较大的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是倒置显微镜下所见未诱导的hFL-MSCs形态图。

图2是倒置显微镜下所见诱导6天后的胰岛β样细胞团的形态图。

图3是未诱导的MSCs的胰岛素阴性表达图；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图4是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(石蜡切片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图5是诱导后所得的胰岛β样细胞团的胰岛素阳性表达图(细胞爬片)；其中图A是胰岛β样细胞胞浆的阳性表达图；其中图B是胰岛β样细胞胞核阳性表达图；图C为图A与图B的合图。

图6是倒置显微镜下所见的诱导后所得的胰岛β样细胞团形态图(细胞爬片)。