[发明专利]诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法

权利要求书

1.诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)人胎肝间充质干细胞的分离、纯化及扩增：先采用分步离心法，再用羟乙基淀粉沉降法分离出人胎肝间充质干细胞；然后将肝间充质干细胞重新悬浮于完全培养基中，反复吹打使细胞分散成单细胞悬液，然后接种培养；细胞达到70％～80％融合时，用D-PBS清洗，再用胰酶进行消化处理，然后首次按1∶2比例传代，以后按1∶3比例传代培养；

(2)诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化：取步骤(1)中第3代以后的达到80％～90％融合的hFL-MSCs，消化、接种、再用诱导液培养6天以上即得到胰岛样细胞团。

2.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述的完全培养基为含有100ml/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基。

3.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述的接种培养包括如下接种培养方法：将细胞按1.5×10⁶/cm²接种于25cm²培养瓶中，在37℃、5％CO₂的培养箱中培养，培养3d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞；以后每2～3d换液1次。

4.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(1)所述用胰酶进行消化处理包括如下过程：加入质量浓度为0.25％的胰酶，浸没所有细胞后倒掉胰酶，然后再加入上述胰酶，倒去大部分，仅剩刚好覆盖细胞的胰酶，在37℃继续消化1～5min，然后加入含有100ml/L FCS、2mmol/L谷胺酰胺、20mmol/L HEPES的DMEM/F12培养基终止消化。

5.根据权利要求1所述的诱导人胎肝间充质干细胞向胰岛β样细胞分化的方法，其特征是，步骤(2)所述的消化、接种、再用诱导液培养包括以下过程：用质量浓度为0.25％的胰酶消化细胞，按1∶2比例接种于25cm²之培养瓶中，每瓶加5mL诱导液，经诱导液培养6天以上即得到胰岛β样细胞团；其中，所述的诱导液为含10ng/ml bFGF，10ng/ml EGF及3％-5％FCS的IMDM培养液。