[发明专利]一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种嗜碱芽孢杆菌及其产生的内切葡聚糖酶和应用。

背景技术

内切葡聚糖酶(β-1，4-内切葡聚糖酶，Endoglucanase/Endo-1，4-β-Glucanase，EC3.2.1.4)是纤维素酶酶系的重要组分，可将纤维素分子从内部即在β-1，4糖苷键将其切断。按催化反应的最适pH值，内切葡聚糖酶可以分为酸性内切葡聚糖酶(最适pH3～5)、中性内切葡聚糖酶(最适pH6～8)和碱性内切葡聚糖酶(最适pH8～10)。酸性内切葡聚糖酶主要由丝状真菌产生，其产生菌主要包括里氏木霉、康宁木霉、黑曲霉等。酸性内切葡聚糖酶研究最早，然而，随着工业应用范围的不断扩展和应用研究的不断深入，酸性内切葡聚糖酶也显现出诸多不足。如中碱性条件下酶活性较低或根本没有活性、稳定性较差、pH值适应范围窄，而且在酸性条件下处理纺织品后会产生退色现象等，这极大限制了内切葡聚糖酶在碱性洗涤剂、纺织品酶洗整理等工业中的应用。

由细菌产生的内切葡聚糖酶主要是中性和碱性内切葡聚糖酶，在中性和碱性条件下均具有一定的酶活性及稳定性。与由真菌产生的酸性内切葡聚糖酶相比，中性和碱性内切葡聚糖酶具有pH值适应范围广、稳定性好、可耐受高温等优点。作为洗涤用酶可使衣物经多次洗涤后手感、外观等保持鲜艳，不易造成纺织品退色等，在纺织、洗涤剂等工业中应用前景广阔。因此，就洗涤剂、纺织等工业而言，由细菌产生的中性和碱性内切葡聚糖酶有着传统酸性内切葡聚糖酶无可比拟的优越性。

目前，对细菌产内切葡聚糖酶的分离纯化研究相对较少，而对细菌产中性内切葡聚糖酶的分离纯化的研究尚未见报道。当前，对于碱性内切葡聚糖酶的研究主要存在菌株产酶能力和酶比活力低或耐金属离子和表面活性剂及热等能力差等诸多不足。同时，嗜碱芽孢杆菌主要产生一些碱性酶类，迄今尚未见嗜碱菌产生中性内切葡聚糖酶的报道。

发明内容

为了解决上述现有技术存在的不足之处，本发明的首要目的在于提供一种嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3。该嗜碱芽孢杆菌可产生一种中性内切葡聚糖酶和一种碱性内切葡聚糖酶。

本发明的另一目的在于提供上述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的优质中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶。它们均具有pH适应范围广、热稳定性好、耐金属离子和表面活性剂等适用于纺织和洗涤剂等工业的优良酶学特性。

本发明的再一目的在于提供上述中性内切葡聚糖酶和碱性内切葡聚糖酶的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种嗜碱芽孢杆菌，是从造纸厂碱性淤泥中筛选得到的产内切葡聚糖酶菌株Bacillus sp.III-3。所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日：2007年8月22日，保藏号：CGMCC No.2138。菌种形态特征：菌落圆形，浅黄色，半透明，革兰氏染色阳性，显微镜下观察个体形态为较细长杆状，次端生芽孢。该菌株的培养基配方(下述均为质量百分比)：1％复合蛋白胨，0.5％酵母粉，0.5％NaCl，0.1％KH₂PO₄，0.25％Na₂HPO₄·12H₂O，2％CMC-Na，0.5％Na₂CO₃(分开灭菌)，固体培养基加1.5％的琼脂，培养pH值：7～10，培养温度：30～37℃。

所述嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3产生的碱性内切葡聚糖酶III-3-A，按下述方法制得：

(1)菌种液体发酵培养：

将嗜碱芽孢杆菌Bacillus sp.III-3菌种接到50mL液体发酵培养基中，于30～35℃、150r/min条件下培养48h；将48h发酵液以14000r/min的转速冷冻离心20min，上清液加入四倍体积的pH8.0 Tris-HCl缓冲液，即得粗酶液。

(2)III-3-A酶蛋白的分离纯化：

(a)离子交换层析

将50mL的粗酶液加到预先用pH8.0 Tris-HCl缓冲液充分平衡的DEAE-Sepharose CL-6B层析柱，依次用含0.4M、0.45M、1M NaCl的pH8.0Tris-HCl缓冲液进行梯度洗脱，并收集有酶活的洗脱峰，将此酶活峰收集、合并、透析、浓缩后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

(b)凝胶过滤层析