[发明专利]治疗性HBV DNA疫苗、制备方法及应用

权利要求书

1.HBV双质粒DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)疫苗质粒pS2.S的构建

将目的基因HBV的包膜中蛋白preS2.S基因插入载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG；

其中构建pS2.S采用的上游引物P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGCTGG CTG CAG AGC CTG-3`，下游引物P2：5`-GGGAATT`C TTA AAT GTATAC CCA AAG ACA A-3`，并于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点；

以pcDNA3.1/preS2.S质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为900bp，回收PCR片段，以HindIII和EcoRI进行双酶切，同时双酶切真核表达载体pVAX1，分别回收酶切片段并进行连接，转化DH5α感受态细菌，筛选Kana抗性的阳性克隆；

(2)佐剂质粒pIIF的构建

将融合的人IL2IFNγ基因插入载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在目的基因起始处引入-3为A，+4为G的KOZAK序列ANNATGG；

构建pIIF采用的上游引物为P1：5`-GGAAGCT`T AGG ATG GGC TACAGG ATG CAA CTC-3`，P2：5`-GGGAATT`C TTA CTG GGA TGC TCT-3`，于两引物分别引入HindIII和EcoRI位点；

以pcDNA3.1/preIL2IFN-γ质粒为模板，采用pfu高保真聚合酶，按95℃5min，94℃50sec，55℃30sec，72℃90sec，30cycles，72℃10minPCR扩增出目的片段，电泳检测大小约为920bp，按前述的方法进行双酶切，连接，转化，挑取克隆酶切测序鉴定；

其中融合的人IL2IFNγ基因中的IL2和IFN-γ通过AGSGGGGS连接肽融合；

(3)HBV双质粒DNA疫苗制备

疫苗质粒pS2.S和佐剂质粒pIIF的制备方法同上，但分开生产，发酵、裂解、纯化方法过程如下：

发酵：以Yeast Extract 8g/L、Tryptone 16g/L、NaCL 4g/L、甘油24ml/L、Na₂HPO₄·H₂O 7.08g/L、KH₂PO₄·12H₂0 1.58g/L；微量氨基酸适量为基础培养基，以Yeast Extract 100g/L+Tryptone 50g/L+甘油400ml/L+MgSO₄ 2g/L+适量氨基酸为恒速流加的补料培养基，按10％接种量，37℃恒温培养，pO2控制在35％以下，在线检测菌密度的OD600值，计算质粒含量，发酵10h收菌，菌体量达50-70g/L，质粒含量为50-70mg/g菌；

裂解：以发酵菌30-32g计，加临用前配置的P1缓冲液900ml混悬，冰浴10min；加临用前配置的P2缓冲液900ml裂解细菌，冰浴4min；加P3缓冲液900ml中和，冰浴10min；离心，4℃，9,000g，15min，上清过G3细菌漏斗，收滤过液；滤过液再过G4细菌漏斗，真空抽滤，收滤过液；滤过液用0.7倍体积异丙醇沉淀，冰浴或放置4℃低温冷柜2h，离心，4℃，9,000g，10min，收集沉淀；70％乙醇洗沉淀后用30ml Buffer I溶解得质粒初提液置4℃保存；

裂解所用试剂组成如下：

●P1：50mM Tris，10mM EDTA，pH8.0

●P2：200mM NaOH，1％SDS，临用前配制

●P3：3.0M KAC，pH5.5

Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

纯化：纯化步骤为：质粒初提液直接上样Sepharose 4 Fast Flow分子筛柱，始终用Buffer I缓冲液，以去除杂蛋白、内毒素、RNA、基因组DNA等，收集洗脱峰用2倍的BufferII稀释上PlasmidSelect即PS柱特异吸附超螺旋DNA的亲和柱进一步纯化，用BufferIII平衡，用BufferIV洗脱的超螺旋质粒峰再用5倍体积的注射用水稀释后上Source 30Q阴离子柱，所述柱用BufferV平衡，用BufferVI洗脱，收集质粒峰并用0.7倍的异丙醇沉淀，用PBS溶解质粒DNA；

纯化所用试剂的组成如下：

●Buffer I：10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●Buffer II：3M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIII：2M(NH₄)₂SO₄，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferIV：2M(NH₄)₂SO₄，1.4M NaCl 10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferV：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

●BufferVI：0.6M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH7.0

PBS溶液：Na₂HPO₄·12H₂O 4.86g，NaH₂PO₄·2H₂O 0.5g，NaCl 9g，定容1000ml；

质粒初提液经分子筛柱，收集洗脱峰上特异吸附超螺旋DNA的亲和柱纯化，最后上阴离子柱，收集质粒峰并用有机溶剂沉淀，用缓冲液溶解质粒DNA。